[發(fā)明專利]一種用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210546243.6
• 申請(qǐng)日: 2012-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103048460A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭俊;朱小波;龐代文;張志凌;余慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢珈源生物醫(yī)學(xué)工程有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577
• 代理公司: 武漢華旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 42214
• 代理人: 劉榮

1.一種用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，其特征是至少采用如下步驟：

（1）.?量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白液的制備：取濃度為1μM-10μM的0.2-2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)平衡至室溫，并用超聲波處理；將量子點(diǎn)、EDC、蛋白均用20mM~200mM?、pH6.0~7.4的磷酸鹽溶液或硼酸鹽溶液溶解；按照1μmol~5μmol?EDC/2nmol量子點(diǎn)的比例加入EDC，EDC即碳二亞胺鹽酸鹽，渦旋振蕩混勻，再按1nmol~100nmol?蛋白/1nmol量子點(diǎn)的比例加入濃度為1~10mg/mL的蛋白，渦旋混勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1-4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為10kDa-100kDa的離心超濾管超濾濃縮至20-100μL，然后采取凝膠尺寸排阻色譜法進(jìn)行純化，收集有熒光的部分，再用離心超濾管濃縮至量子點(diǎn)濃度為0.2-2μmol/L，保存于10mM-100mM、?pH為7.4~9.0的、含有質(zhì)量百分比濃度為0.05%的NaN₃的硼酸鹽緩沖液中，2~8℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）.?量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白檢測(cè)液的制備：將上述量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白液取出放置至室溫，用PBS-TBN稀釋100-1000倍成量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白檢測(cè)液，PBS-TBN為含20mM-150mM氯化鈉NaCl、0.02%-0.1%?吐溫Tween-20、2mg/mL-10m/mL?牛血清白蛋白BSA、0.05%?疊氮化鈉NaN₃的10mM-100mM磷酸鹽緩沖液PB，然后置于2~8℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）.?制備包被有檢測(cè)指標(biāo)的反應(yīng)膜：檢測(cè)指標(biāo)為抗體或抗原，以硝酸纖維素膜為反應(yīng)膜，將反應(yīng)膜固定粘貼在PVC背襯的中間部位，將抗原或抗體用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.1~5mg/mL，并將二抗IgG用包被緩沖也調(diào)節(jié)濃度至0.1~5mg/mL，按照0.8~1.2uL/cm的膜液量，將抗原或抗體，以及二抗IgG噴到反應(yīng)膜上對(duì)應(yīng)的檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)上進(jìn)行包被，檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)之間間隔為3~7mm，放置25~37℃烘箱處理1-3小時(shí)，置于恒溫恒濕保藏箱里備用，所用包被緩沖液為含有20mM-150mM氯化鈉NaCl、0.05%-3%?聚乙二醇PEG20000、0.2%-1%?海藻糖、2mg/mL-10m/mL?牛血清白蛋白BSA、0.05%?疊氮化鈉NaN₃的10mM-100mM磷酸鹽緩沖液PB；

（4）.?在上述PVC背襯上順序粘貼樣品墊、步驟（3）制得的反應(yīng)膜以及吸水墊，得到試紙板，將試紙板切割成試紙條，將試紙條裝載于試紙卡內(nèi)，得量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條；

（5）.?定性或定量檢測(cè)：取300uL-500μL量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白檢測(cè)液與10μL?-50μL待檢測(cè)樣本充分混勻后，取60μL-100μL混合液加入到試紙卡上的加樣孔內(nèi)，反應(yīng)3-15min即可讀取結(jié)果；

（5.1）定性檢測(cè)或半定量檢測(cè)：采用紫外燈照射加樣反應(yīng)后的反應(yīng)膜區(qū)域，通過(guò)肉眼觀察條帶發(fā)光情況，如果體系為檢測(cè)大分子物質(zhì)的雙抗夾心法，當(dāng)檢測(cè)線出現(xiàn)熒光信號(hào)時(shí)判定該指標(biāo)為陽(yáng)性；不出現(xiàn)熒光信號(hào)則為陰性；如果檢測(cè)體系為檢測(cè)小分子物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)法，則結(jié)果相反，出現(xiàn)熒光信號(hào)的檢測(cè)線報(bào)告為陰性，未出現(xiàn)熒光信號(hào)報(bào)告為陽(yáng)性；無(wú)論采取哪種方法，如果控制線沒(méi)有熒光信號(hào)則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；

（5.2）定量檢測(cè)：配備一系列不同濃度的待檢分子標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后利用熒光定量分析儀分別進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，通過(guò)對(duì)每個(gè)峰面積對(duì)應(yīng)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將待檢未知樣品進(jìn)行同樣處理，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得知樣品中待測(cè)分子含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1?所述用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，其特征是：所述量子點(diǎn)為羧基水溶性核殼型量子點(diǎn)，量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍是500nm-630nm，在激發(fā)光源輻射作用下能夠發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光，其熒光量子產(chǎn)率不低于45%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1?所述用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，其特征是：所述檢測(cè)指標(biāo)為抗原，則檢測(cè)液中的標(biāo)記抗體和反應(yīng)膜檢測(cè)區(qū)的包被抗體，應(yīng)為相應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的單克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1?所述用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，其特征是：所述檢測(cè)指標(biāo)為抗體，則其檢測(cè)液中的標(biāo)記抗原和反應(yīng)膜檢測(cè)區(qū)的包被抗原，應(yīng)為相應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的基因工程重組抗原。

5.根據(jù)權(quán)利要求1?所述用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，其特征是：所述樣品墊為玻璃纖維墊，吸水墊為普通吸水紙。