[發明專利]一種在貝類幼蟲中定量檢測甲狀腺激素的方法

有效

• 申請號: 201210545897.7
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103529226A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 黃雯;闕華勇;許飛;李莉;張國范
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: G01N33/78
• 分類號: G01N33/78;G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

技術領域

本發明涉及生物學領域，具體說是一種簡單快速準確的測定貝類中的甲狀腺激素含量的方法。

背景技術

甲狀腺激素包含甲狀腺素（T4）和3，5，3′-三碘甲腺原氨酸（T3）在脊椎動物中廣泛存在，對生長發育，能量代謝和變態有重要作用。人類中與甲狀腺激素相關的疾病很多，如呆小癥，甲狀腺腫大，甲亢等。為預防，診斷，治療這些疾病，在人等高等動物中已經有一套非常成熟的檢測手段，如放射性免疫，酶聯免疫，電化學發光法等。

近年來對甲狀腺激素的進化研究是一個熱點。但甲狀腺激素在冠輪動物分支，特別是在貝類中的研究鮮見。在研究過程中直接檢測其含量是其功能研究中最有力的手段之一。但放射性免疫，酶聯免疫，電化學發光法都是以動物血清為檢測目標，不能直接適用于組織中或無法獲得血清的樣本中甲狀腺激素含量的檢測。如果借用該檢測系統，必須對樣品進行預處理。而樣品預處理的方法流程能直接決定最終檢測結果是否準確。

在貝類幼蟲中檢測甲狀腺激素有其特有的難度：1、貝類的卵或幼蟲通常很小，需要收集大量的幼蟲，收集同時會混有大量的海水，則不能以濕重為單位。2、幼蟲發育過程中出現貝殼，不同時期中貝殼所占的體重的比例不同，均一化方法最好采用每克蛋白中含甲狀腺激素x克（xg/g?protein）。

發明內容

本發明的目的是針對貝類幼蟲樣品中含有海水，且不同發育時期含殼量不同，不容易均一化等問題。提供一種快速，簡單的樣品預處理方法結合對人的甲狀腺激素檢測系統，實現對貝類幼蟲樣品中甲狀腺激素的定量檢測。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種在貝類幼蟲中定量檢測甲狀腺激素的方法，該方法包括如下步驟：

1）將幼蟲樣品用液氮研磨法研磨成粉末狀；

2）研磨后進行低溫干燥，分成AB兩部分分別用于以下步驟；

3）將A部分樣品準確稱量干重后，按固定比例加入0.01mol/L?NaOH溶液，2-8℃下充分浸潤1h以上提取甲狀腺激素；

4）8000-12000rpm離心5-10min，取上清；

5）取步驟4）中的上清，用于定量檢測甲狀腺激素的含量，即總甲狀腺素T4（xg/g干重）和總3，5，3′-三碘甲腺原氨酸T3（xg/g干重）；

6）將B部分樣品準確稱量干重后加入細胞裂解液和PMSF室溫放置1h以上，裂解細胞釋放蛋白；

7）將步驟6）中裂解細胞釋放蛋白用于檢測樣品中總蛋白含量x?gprotein/g干重；

8）將數據整合，計算出幼蟲中每克蛋白含甲狀腺激素x克（xg/gprotein）。

步驟1）中所述的含水幼蟲樣品在液氮中冷凍成固體后，用研缽研磨成粉末狀。

步驟2）中所述低溫干燥是指用冷凍干燥儀-20℃至-50℃避光條件下干燥8-12h至完全干燥。

步驟3）中所述固定比例是指按照每1g干重中加入5ml的0.01mol/LNaOH溶液。

步驟5）中所述定量檢測總的甲狀腺素的含量是采用羅氏2010全自動生化分析儀定量檢測甲狀腺素的含量。

步驟6）中細胞裂解液和PMSF的加入量能夠使樣品完全裂解即可。

步驟7）中所述檢測樣品中總蛋白含量是采用BCA蛋白測定試劑盒檢測樣品中總蛋白含量。

本發明具有以下優點：

1．本發明提供的方法能簡單，快速，準確的測定出貝類中的甲狀腺激素含量。

2．本發明提供的方法中的樣品預處理步驟簡單，無毒操作。

3．本發明提供的方法能適用于兩種甲狀腺激素的定量檢測，即甲狀腺素T4（xg/g?protein）和3，5，3′-三碘甲腺原氨酸T3（xg/g?protein）。

附圖說明：

圖1為T4標準品色譜峰圖，出峰時間為11.957min。

圖2為T3標準品色譜峰圖，出峰時間為7.505min。

圖3為牡蠣幼蟲樣品色譜峰圖，A峰:11.901min，B峰:7.535min。

具體實施方式

下面的實施例中將以長牡蠣為實驗對象對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。以下甲狀腺素用T4簡寫表示，3，5，3′-三碘甲腺原氨酸用T3簡寫表示

實施例一

高效液相色譜法（HPLC）在牡蠣中定性測定甲狀腺激素。