[發(fā)明專(zhuān)利]一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚增殖的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210545895.8
• 申請(qǐng)日: 2012-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103013930A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟照潔;宮玉珍;楊靈芝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及屬于獸用生物制品培育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚增殖的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

新城疫(Newcastledisease)是由新城疫病毒(Newcastledisease?virus,NDV)引起一種雞的急性、高度接觸性傳染病，常呈敗血性經(jīng)過(guò)，以呼吸困難、下痢、神經(jīng)機(jī)能紊亂、粘膜和漿膜出血為主要特征。該病發(fā)病急，感染率和死亡率均較高，有時(shí)甚至高達(dá)100%，給養(yǎng)禽業(yè)，尤其是養(yǎng)雞業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，因此被我國(guó)定為一類(lèi)傳染病，國(guó)際獸疫局定為A類(lèi)傳染病。

NDV具有血凝性(HA)，NDV囊膜表面纖突上的血凝素能與紅細(xì)胞表面的受體結(jié)合，引起紅細(xì)胞凝集。NDV可凝集所有兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、禽類(lèi)及小鼠、豚鼠的紅細(xì)胞，但凝集牛、山羊、綿羊、豬、馬及人0型血紅細(xì)胞的能力則隨毒株的不同而異。該病毒可在9-11日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養(yǎng)。

雞傳染性支氣管炎（Avian?Infectious?Bronchitis，AIB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious?Bronchitis?Virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病。該病于1930年在美國(guó)北達(dá)科塔州首次發(fā)現(xiàn)，由Schalk和Hawn（1931）首次報(bào)道。Beach和Schalm（1936）通過(guò)雞的交叉免疫研究證明傳染性支氣管炎病毒與傳染性喉氣管炎病毒不同，再次證實(shí)IBV的濾過(guò)性，確定其病原為病毒。呼吸道上皮細(xì)胞為IBV原發(fā)的和主要的增殖部位，感染的雞表現(xiàn)為氣管啰音、咳嗽、打噴嚏等；但部分毒株也可以在感染雞的腎臟、輸卵管和腸道等組織器官的上皮細(xì)胞中復(fù)制和增殖，引起輸尿管擴(kuò)張，腎臟腫大、蒼白，呈現(xiàn)典型的“花斑腎”，造成感染雞發(fā)生死亡或產(chǎn)蛋母雞的產(chǎn)蛋量下降以及蛋品質(zhì)的下降。雞傳染性支氣管炎造成的經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重，主要包括：飼料報(bào)酬下降，增重減少，并發(fā)感染引起氣囊炎使肉雞在加工過(guò)程中被淘汰，產(chǎn)蛋下降和蛋品質(zhì)下降等所造成的經(jīng)濟(jì)損失往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于由本病直接致死造成的損失，同樣可以給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，生物制品行業(yè)也得到了迅速發(fā)展，尤其是生物技術(shù)的不斷更新使疫苗產(chǎn)品的種類(lèi)顯著增加，且品種多樣，使用疫苗可有效地防止這兩種禽病的發(fā)生。其中雞新城疫與傳染性支氣管炎的二聯(lián)苗，其效力與單苗基本相同，具有使用簡(jiǎn)便、接種程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，這類(lèi)多聯(lián)苗的發(fā)展為一種趨勢(shì)。目前通常制備雞新城疫與傳染性支氣管炎疫苗的方法是先分別制備這兩種病毒，然后按一定比例混合后制成苗，這樣既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且生產(chǎn)成本也較高。因此，針對(duì)現(xiàn)有的雞新城疫與傳染性支氣管炎分別培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)材料的現(xiàn)狀，我們急需要改進(jìn)新城疫、傳染性支氣管炎培養(yǎng)方式，達(dá)到一次培養(yǎng)兩種抗原的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足進(jìn)行改進(jìn)，提出了一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚增殖的培養(yǎng)方法，本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)新城疫、傳染性支氣管炎兩種病毒共存的最佳濃度比例、接胚日齡、孵化溫度、和收胚時(shí)間，使新城疫、傳染性支氣管炎兩種病毒能夠產(chǎn)生最好的共存，在同胚上接種并生產(chǎn)兩種病毒。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)如下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

（1）將新城疫毒種LaSota株毒種稀釋成10⁶EID₅₀，傳染性支氣管炎毒株M41株用PBS液稀釋成10³EID₅₀，稀釋后將兩種病毒液以1:1的比例混合。

（2）將混合后毒種接種至11日齡易感雞胚尿囊內(nèi)，每胚接種尿囊腔0.15ml，接種后用蠟封接種孔和氣孔；

（3）將接種后雞胚放到培養(yǎng)箱，在36.5℃下進(jìn)行孵化；

（4）72小時(shí)前每24小時(shí)照胚一次，72小時(shí)后每6小時(shí)照胚一次，棄去72h前的死亡胚，留下72-96h時(shí)間段的死亡胚和96h的活胚，將活胚在2-8℃環(huán)境下冷卻12h，將冷卻的雞胚取出，放入收胚室，將蛋殼的氣室部位用碘酒消毒后，以無(wú)菌手術(shù)剝?nèi)馐也课坏牡皻?，將蛋殼膜，用尖頭小鑷子將絨毛尿囊膜及羊膜撕破，檢查胚液是否渾濁或有異物，如果沒(méi)有則抽取胚液，收集，即得雞新城疫、傳染性支氣管炎抗原。

其中新城疫毒種LaSota株和傳染性支氣管炎毒株M41株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定保存，LaSota株保藏號(hào)為CVCC?AV1615；M41株保藏號(hào)為CVCC?AV1511。