[發(fā)明專利]一種豬增生性腸炎胞內(nèi)勞森氏菌的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210545867.6
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102994641A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭顯坡;陳申秒;蔡培軍
• 申請（專利權(quán)）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬增生性腸炎胞內(nèi)勞森氏菌的SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法。

背景技術(shù)

豬增生性腸炎（porcine?proliferative?enteritis，PPE）是由豬胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia?intracellularis，LI）引起的豬的接觸性傳染病。胞內(nèi)勞森氏菌是一種彎曲的專性胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在豬以及其他動物的回腸、結(jié)腸、盲腸部位，造成未成熟的腸道上皮細胞腺瘤樣增生。目前，該病已呈全球性流行，隱性感染豬較多，損失易被忽視，亞洲地區(qū)的中國、日本、韓國及臺灣地區(qū)近年來多次發(fā)生豬增生性腸炎，豬感染率后，導致頑固性腹瀉，造成豬只生長發(fā)育遲緩，嚴重降低飼料報酬率。另外該病經(jīng)常存在混合感染其它病毒和細菌性疾病，致使臨床癥狀表現(xiàn)更加復(fù)雜化，很難做出準確判斷，特別是不易與仔豬副傷寒﹑豬傳染性胃腸炎（TGEV）﹑豬流行性腹瀉（PEDV）腹瀉性疾病相區(qū)別等。因此，建立有效的鑒別診斷方法和檢測系統(tǒng)成為進行其他研究的前提條件。

熒光染料定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)管中加入熒光染料，這種染料可嵌入雙鏈DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。隨著擴增反應(yīng)的延伸，熒光信號會因為DNA產(chǎn)物的增加而增加，因此SYBR?GreenⅠ熒光信號的積累與擴增出的雙鏈DNA的數(shù)量成正相關(guān)。目前將該方法應(yīng)用到豬增生性腸炎胞內(nèi)勞森氏菌檢測上的嘗試還不多見，本發(fā)明旨在建立針對豬增生性腸炎胞內(nèi)勞森氏菌的熒光定量PCR快速檢測診斷方法，為該病的早期診斷防制及流行病學調(diào)查提供技術(shù)支持，同時為PPE的分子檢測試劑盒的研制打下良好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬增生性腸炎胞內(nèi)勞森氏菌的SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法，該方法具有操作簡便，敏感性高，重復(fù)性好，污染少，用時短和可自動定量分析等優(yōu)點，能夠檢測出常規(guī)PCR無法檢測的病料，同時也免去了DNA水平電泳的步驟，更加省時，為該病的早期診斷防制及流行病學調(diào)查提供技術(shù)支持。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過如下步驟來實現(xiàn)的：

（1）將回腸或盲腸等病料剪碎后，加入5ml的PBS進行研磨，加入濃度均是1000U/ml的青﹑鏈霉素各1ml，將組織懸液放入-20℃條件下，反復(fù)凍融3次，融化后于12000?rpm離心5min，取上清，加入SDS、蛋白酶K混勻，50℃下裂解1.5h，加入體積比酚:氯仿為1:1的酚和氯仿，使病料組織變性，利于DNA的釋放，取下層抽提，取上清液加體積比氯仿:異戊醇為1:1的氯仿和異戊醇，提取和純化DNA，去除其它雜質(zhì)，再抽提1次，取上清液加1/10體積3M/L?的NaAc，2倍體積無水乙醇，于-20℃下沉淀1h，4℃下12000rpm，離心10min，棄上清液，沉淀即為DNA，用75%乙醇沖洗2次，緩慢倒出乙醇，將沉淀室溫晾干，加入適量ddH₂O溶解DNA，于-20℃保存或立即做PCR檢測。

（2）根據(jù)GenBank中的LI?aspA基因（AY280626），設(shè)計一對特異性引物，引物序列如下：

PPE-1-F：5--TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG--3

PPE-1-R：5--TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC--3

其中PPE-1-F／R預(yù)期擴增片段為227bp。

（3）加入PCR?Mix?12.5?μL，10?pM上、下游引物各1?μL，Rnase?Free?water?8.5?μL，DNA模板或重組質(zhì)粒2.0μL，將EP管置PCR儀，按如下程序進行擴增：94℃?5min；94℃?30s、55℃?30s、72℃?40s，共35個循環(huán)；72℃延伸10?min，反應(yīng)結(jié)束后，取5μL?PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，將擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的凝膠電泳分析并回收﹑純化。

（4）將回收純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-?T?Vector上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，篩選得到單菌落，挑取單個菌落接種至培養(yǎng)液中過夜振蕩培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒DNA作為模板進行PCR鑒定，并將重組質(zhì)粒進行測序鑒定。