[發明專利]一種豬增生性腸炎胞內勞森氏菌的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201210545867.6
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102994641A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 郭顯坡;陳申秒;蔡培軍
• 申請（專利權）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

1.一種豬增生性腸炎胞內勞森氏菌的SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法，其特征在于其檢測方法的具體步驟如下:

（1）提取豬胞內勞森氏菌的DNA，制備檢測液；

（2）根據GenBank中的LI?aspA基因（AY280626），設計一對特異性引物，引物序列如下：

PPE-1-F：5--TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG--3

PPE-1-R：5--TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC--3

其中PPE-1-F／R預期擴增片段為227bp；

（3）加入PCR?Mix?12.5?μL，10?pM上、下游引物各1?μL，Rnase?Free?water?8.5?μL，DNA模板或重組質粒2.0μL，將EP管置PCR儀，按如下程序進行擴增：94℃?5min；94℃?30s、55℃?30s、72℃?40s，共35個循環；72℃延伸10?min，反應結束后，取5μL?PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，將擴增的PCR產物經2%的凝膠電泳分析并回收﹑純化；

（4）將回收純化后的PCR產物連接到pMD18-?T?Vector上，轉化至感受態細胞，篩選得到單菌落，挑取單個菌落接種至培養液中過夜振蕩培養，提取重組質粒，以提取的質粒DNA作為模板進行PCR鑒定，并將重組質粒進行測序鑒定；

（5）提取經過測序鑒定正確的重組質粒，應用紫外分光光度計測定重組質粒濃度，計算出基因拷貝數，將重組質粒進行10倍系列稀釋，共做6個稀釋度：10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷，將其作為標準質粒模板；

（6）取標準質粒模板，構建反應體系，進行SYBR?Green?I熒光定量PCR擴增，獲得擴增動力學曲線及標準曲線；

（7）分別以TGEV、RV、PEDV反轉錄后的cDNA和大腸桿菌、沙門氏菌﹑LI陽性對照的DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，同時設NTC，,驗證本發明方法的特異性；

（8）將已計算出拷貝數的質粒做10倍梯度稀釋,選取10^-9、10^-10、10^-11、10^-12﹑10^-13稀釋的五個濃度梯度進行熒光定量PCR檢測,以此確定出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數，驗證本發明方法的敏感性；

（9）將已知的標準品分別進行批內、批間重復性試驗，驗證本發明中方法的穩定性和重復性；

（10）對采自山東省內疑似PPE發病豬的盲腸、回腸組織樣品及糞便樣品處理后，分別進行熒光定量PCR檢測和常規PCR擴增，同時設陽性標準對照和陰性對照，用于對比本發明方法的優良之處。

2.根據權利要求1所述的一種豬增生性腸炎胞內勞森氏菌的SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法，其特征在于提取DNA的方法為：將回腸或盲腸等病料剪碎后，加入5ml的PBS進行研磨，加入濃度均是1000U/ml的青﹑鏈霉素各1ml，將組織懸液放入-20℃條件下，反復凍融3次，融化后于12000?rpm離心5min，取上清，加入SDS、蛋白酶K混勻，50℃下裂解1.5h，加入體積比酚:氯仿為1:1的酚和氯仿，?取下層抽提，取上清液加入體積比氯仿:異戊醇為1:1的氯仿和異戊醇再抽提1次，取上清液加1/10體積3M/L?的NaAc，2倍體積無水乙醇，于-20℃下沉淀1h，4℃下12000rpm，離心10min，棄上清液，沉淀即為DNA，用75%乙醇沖洗2次，緩慢倒出乙醇，將沉淀室溫晾干，加入適量ddH₂O溶解DNA，于-20℃保存或立即做PCR檢測。

3.根據權利要求1所述的一種豬增生性腸炎胞內勞森氏菌的SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：步驟6-10中，所述的熒光定量PCR反應體系如下：總反應體積25uL，其中ddH₂O?10.5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，2×One?Step?SYBR?Green?I?Premix預混酶12.5ul，質粒模板1ul；熒光定量PCR反應條件如下：94℃?預變性3?min；94℃30?s，56℃30s，72℃30s?，同時在72℃延伸過程中收集熒光信號，40個循環，同時設溶解曲線反應循環參數為：95℃?15?s，60℃?30?s，95℃15?s。