[發明專利]一種包含弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶表達元件的真核表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210545335.2
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103865947A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 陳勇;蔣琳;陸儉;雷清;馬亞茹;李剛
• 申請（專利權）人: 蘭州生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海翰鴻律師事務所 31246
• 代理人: 李佳銘

技術領域

本發明涉及一種基因工程載體，具體涉及一種真核表達載體，尤其涉及可高效篩選高表達克隆的真核表達載體。

背景技術

CHO細胞表達系統是目前廣泛應用的真核表達系統之一，與其它表達系統相比，其優點是具有良好的蛋白質翻譯后修飾功能，表達的目標蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子，缺點是獲得高表達細胞株所需的時間長、細胞大規模培養的成本高等。因此，快速篩選、獲得高水平表達外源基因的CHO細胞株是基因工程和生物制藥領域內的研究熱點。

在哺乳動物細胞中外源基因的高效表達依賴于許多因素，包括轉錄、翻譯控制元件、RNA代謝、基因拷貝數、mRNA穩定性、基因在宿主細胞染色體上的定位等。通常認為，外源基因的整合位點和/或拷貝數可極大地影響目的基因的表達強度。目前，在CHO(DHFR^-)細胞中采用包含DHFR共擴增基因的表達載體，是獲得高表達細胞株的常用策略之一。

DHFR(二氫葉酸還原酶)基因是常用的篩選標記基因，具有擴增目的基因的功能，又稱共擴增基因。DHFR基因編碼的二氫葉酸還原酶是細胞代謝途徑中的一個重要的酶，氨甲喋呤(MTX)是二氫葉酸還原酶的競爭抑制性底物，當環境存在高濃度的MTX?時，為了維持細胞的正常代謝，二氫葉酸還原酶基因的拷貝數不斷增加，同時，其側翼的目的基因拷貝得以擴增，從而實現外源基因的高表達。

DHFR標記基因/CHO(DHFR^-)細胞/MTX加壓篩選系統的篩選作用，可以通過弱化DHFR標記基因的基礎表達進一步加強。已有多份文獻報道通過加速DHFR?mRNA的降解，或者利用DHFR的氨基酸序列突變來降低酶活性以及弱化DHFR基因的啟動子，部能有效提高外源基因的表達。例如，白銀等將采用弱化的SV40啟動子與DHFR基因結合，用于提高抗人膀胱癌人鼠嵌合抗體的表達，獲得了肯定得結果，參見《細胞與分子免疫學雜志》，2003，19(1)：62-64。

盡管如此，大多數的研究者只是利用包含DHFR基因的表達元件針對不同的載體、不同的目的基因進行個性化改造，研究結果缺乏普適性。本領域迫切需要一種在CHO(DHFR^-)細胞中高水平表達目的基因的通用載體，適用于快速構建共表達DHFR基因的多種外源基因，便于后期快速篩選高表達克隆，以克服以往篩選克隆時費時費力的缺點。

發明內容

本發明需要解決的技術問題之一是提供一種適合CHO(DHFR^-)細胞高水平表達目的基因的通用載體；本發明需要解決的另一技術問題是提供上述載體的構建方法。

本發明的第一方面，提供了一種真核表達載體pCMV-WD。該載體是以pBudCE4.1載體為基礎改構獲得，基礎載體上肽鏈延長因子基因啟動子(P_EF-1α)及其下游的多克隆位點被弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件替換，基礎載體上巨細胞病毒早期啟動子(P_CMV)下游的多克隆位點被新的多克隆位點替換。

所述的弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件見SEQ.No.1，該表達原件長度為973bp。其中“弱化的SV40啟動子”為5’端11-356位核苷酸序列，“二氫葉酸還原酶基因”為位于3’端400-963位核苷酸序列，兩者之間為43個核苷酸的連接序列。5’端5-10位核苷酸為Nhe?I識別序列(GCTAGC)，最末端為4個保護性核苷酸GCGC；3’端964-969位核苷酸為BstB?I識別序列(TTCGAA)，最末端為4個保護性核苷酸GCGC。

所述的弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件被插入到pBudCE4.1載體的Nhe?I和BstB?I內切酶位點之間，基礎載體Nhe?I和BstB?I之間的肽鏈延長因子基因啟動子(P_EF-1α)及其下游的多克隆位點，總長度為1246bp的片段被SEQ.No.1的弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件替換。