[發明專利]一種包含弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶表達元件的真核表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210545335.2
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103865947A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 陳勇;蔣琳;陸儉;雷清;馬亞茹;李剛
• 申請（專利權）人: 蘭州生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海翰鴻律師事務所 31246
• 代理人: 李佳銘

1.一種真核表達載體，該載體是以pBudCE4.1載體為基礎載體改構獲得，其特征在于：(1)基礎載體上肽鏈延長因子基因啟動子(P_EF-1α)及其下游的多克隆位點被弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件替換；(2)基礎載體上巨細胞病毒早期啟動子(P_CMV)下游的多克隆位點被新的多克隆位點替換。

2.根據權利要求1所屬的載體，其特征在于，所述的基礎載體上肽鏈延長因子基因啟動子(P_EF-1α)及其下游的多克隆位點指基礎載體上Nhe?I和BstB?I之間1246bp的片段。

3.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的弱化的SV40啟動子/二氫葉酸還原酶基因表達元件指SEQ.No.1所示的核苷酸序列。

4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，基礎載體上巨細胞病毒早期啟動子(P_CMV)下游的多克隆位點Hind?III、Pst?I、Sal?I、Acc?I、Sca?I、Xba?I、BamH?I被新的多克隆位點Hind?III(*)、Pst?I、EcoR?V、Not?I、Xho?I、Sal?I、BamH?I替換；其中，Hind?III(*)位點為無效位點。

5.根據權利要求4所述的載體，其特征在于，基礎載體上巨細胞病毒早期啟動子(P_CMV)下游的多克隆位點序列5’-CTGCAG…GGATCC-3’被新的多克隆位點序列5’-CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCC-3’所替換。

6.一種真核表達載體的構建方法，包括如下步驟：

(1)合成如核苷酸序列SEQ.No.1所示的弱化的SV40啟動子及其下游的二氫葉酸還原酶基因構成的表達元件；

(2)合成如核苷酸序列SEQ.No.3所示的多克隆位點/工作DNA序列片段；

(3)基礎載體pBudCE4.1、弱化的SV40啟動子及其下游的二氫葉酸還原酶基因構成的表達元件用Nhe?I和BstB?I雙酶切，回收，連接，得到中間載體1；

(4)中間載體1與多克隆位點/工作DNA序列片段用Pst?I和Xba?I雙酶切，回收，連接，得到中間載體2；

(5)中間載體2用BamH?I單酶切，回收，連接，得到本發明的真核表達載體pCMV-WD。

7.根據權利要求5的方法，其特征在于，所述的多克隆位點/工作DNA序列片段通過PCR方法制備，PCR擴增的模板序列如SEQ.No.2所示，PCR擴增的引物為：

上游引物：5’-CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCCTCCCTGTCTGCCTCT?CTGGGAG-3’；

下游序列：5’-TCTAGAACGTTTGATTTCCAG-3’。