[發明專利]基于量子點的免疫熒光微流控芯片及其制法和用途

無效

• 申請號: 201210545258.0
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103018437A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 朱俊杰;曹俊濤
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;B01L3/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 黃嘉棟

1.一種免疫熒光微流控芯片，其特征是：它是由兩片聚二甲基硅氧烷(PDMS)疊合而成，上層由集成有入口微流路和細胞培養微腔的PDMS薄膜構成，PDMS膜厚度為2±0.5mm，所述的入口微流路是由一條長5±0.5mm的入口流路下接多條入口分支流路構成，多條入口分支流路與一個長2.5±0.5mm、寬2±0.5mm的細胞培養微腔相通，在細胞培養微腔的入口微流路的相對方向有出口微流路，出口微流路與入口微流路相對應，也由與細胞培養微腔相通的多條出口分支流路和出口流路構成，多條入口分支流路和多條出口分支流路可以保證液體均勻地流入和流出細胞培養微腔；下層由集成有微坑陣列的PDMS薄膜構成，所述的PDMS膜厚度為200±20μm，微坑陣列為40±10行、35±10列微坑組成的，微坑為圓形，直徑為30±5μm，深度為25±5μm，相鄰兩微坑邊界距離為25±5μm，上層PDMS薄膜的細胞培養微腔與下層PDMS薄膜的微坑陣列對齊，兩層PDMS薄膜通過氧等離子體處理后進行不可逆封接，構成基于量子點的免疫熒光微流控芯片。

2.根據權利要求1所述的免疫熒光微流控芯片，其特征是：所述的入口微流路是由一條入口流路連接兩條分支流路，每條分支流路又連接兩條二級分支流路，四條二級分支流路與細胞培養微腔相通。

3.根據權利要求2所述的免疫熒光微流控芯片，其特征是：所述的出口分支流路與入口分支流路相對應。

4.根據權利要求1所述的免疫熒光微流控芯片，其特征是：所述的微流路是寬0.2±0.05mm、深60±5μm的液流管道，所述的細胞培養微腔深60±5μm。

5.一種制備權利要求1所述的免疫熒光微流控芯片的方法，其特征是它包括如下步驟：

步驟1.?免疫熒光微流控芯片模具的制備：

按上述的免疫熒光芯片的參數，用直徑52mm的單拋硅片為模板，在上面旋涂一層60±5μm厚的SU-8?2050?負光刻膠，經過前烘65℃、?3min和?95℃?、5min，然后通過集成有微管道和培養微腔的掩模板進行光刻，

然后經過后烘65℃?、3min和?95℃、5min?，顯影、固膜后得到制備集成有微管道和培養微腔的上層PDMS薄膜的硅片模具；用直徑52mm的單拋硅片為模板，在上面旋涂一層25±5μm厚的光刻膠，前烘、曝光及后烘參數同上，經顯影、固膜后得到制備集成有微坑陣列的下層PDMS薄膜的硅片模具；

步驟2.?免疫熒光芯片的制備：?

將單體和固化劑質量比為20:1?的PDMS充分混合，抽真空10min后，澆注在步驟1得到的具有微流路和培養微腔的硅片模具上，靜置?1?min后放置于70℃烘箱內烘2h，從硅片模具上剝離PDMS膜，膜厚2±0.5mm，裁切為合適大小，制得具有微流路和培養微腔的PDMS芯片；將具有微坑陣列的硅片模具放置在勻膠臺上，然后將單體和固化劑質量比為10:1?的PDMS約3g傾倒在硅片模具上，1000轉，30s，后放置于70℃烘箱內烘2h，從硅片模具上剝離PDMS膜，裁切為合適大小制得具有微坑陣列的PDMS芯片，芯片厚度200±20μm，兩PDMS膜用洗潔凈清洗后，分別于乙醇、二次水中超聲10min，氮氣吹干后放于烘箱內70℃?烘1h，將烘干的集成微流路和培養微腔的PDMS薄膜和集成有微坑陣列的PDMS薄膜置于氧等離子清洗器內處理1min，將兩片芯片對齊后封合，用75%乙醇溶液進行消毒處理后，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）沖洗后即得免疫熒光微流控芯片。

6.根據權利要求3所述的制備免疫熒光微流控芯片的方法，其特征是：步驟1所述的進行光刻是功率為24?mW/cm²,時間是8s。

7.權利要求1所述的免疫熒光微流控芯片在單細胞水平膜表面糖基表達分析中的應用。

8.根據權利要求5所述的免疫熒光微流控芯片在單細胞水平膜表面糖基表達分析中的應用，其特征是具體步驟如下：

步驟1.?將1?×?10⁶~5?×?10⁶cells?mL^-1細胞懸液通過重力作用從入口流路引入細胞培養微腔內；

步驟2.?通過平衡出入口液面高度使液流保持靜止，讓細胞通過重力作用進入微坑；

步驟3.?通過抬高出口液面高度使液流向相反方向流動，重復步驟2，再次實現細胞捕獲；

步驟4?重復步驟2和3，得到滿意細胞捕獲效率；

步驟5.?經PBS（磷酸鹽緩沖溶液）沖洗未沉降細胞后，引入甲醛固定細胞，經三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液沖洗，牛血清白蛋白封閉后引入凝集素孵育，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液-吐溫20沖洗，牛血清白蛋白封閉后，引入凝集素抗體孵育，沖洗封閉后引入CdTe量子點探針；

步驟6.?三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液-吐溫20沖洗后，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下拍照并分析。