[發明專利]一種特立齊酮中D-環絲氨酸含量的測定分析方法

有效

• 申請號: 201210545033.5
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103869040A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 董偉強;安建國;張席妮
• 申請（專利權）人: 上海科勝藥物研發有限公司
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及用2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生D-環絲氨酸，用高效液相色譜法測定衍生物的含量，從而計算出特立齊酮中D-環絲氨酸的含量。此方法能較好的控制原料藥中D-環絲氨酸含量，為患者的健康用藥提供保障，屬于醫藥技術領域。

技術背景

特立齊酮，化學名

4，4′-[1，4-Phenylenebis(methylidynenitrilo)]bis(isoxazolidin-3-one)

為一種抗結核、麻風分支桿菌類藥物。結構如下：

特立齊酮中含有反應殘留或者降解產生的D-環絲氨酸，結構如下：

準確定量地測定特立齊酮中的D-環絲氨酸含量極具挑戰性。D-環絲氨酸極性很大，不具備敏感的紫外吸收基團，并且在酸堿條件下不夠穩定。更為復雜的是特立齊酮本身在水存在的條件下，會生成D-環絲氨酸。其生成含量取決于系統中水的含量高低。其水解平衡如下：

因此，很難采用氣相、液相色譜和其他分析手段對其進行直接測定。此外，由于分析測定系統中存在有不確定量的水而產生不確定量的D-環絲氨酸使得分析結果的準確性變得很不確定，常使分析結果偏高，并且無法控制結果的精密度。

目前，測定特立齊酮中D-環絲氨酸含量的方法采用經典的比色法，其專一性、靈敏度、方法精密度和重復性都存在很大的缺陷，不能提供可靠的分析結果。為了克服原方法的缺陷，本發明采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)作為衍生試劑與D-環絲氨酸形成穩定的衍生物。形成的衍生物具備優異的液相色譜分離和紫外檢測等特征。該分析方法具有專一性好、靈敏高、重現性好等特點。

發明內容

如上所述，直接定量測定D-環絲氨酸存在各種缺陷。然而，利用D-環絲氨酸帶有伯胺基團這一特征，可改造其特性使之轉化為適合定量分析的分子結構。利用2，4-二硝基氟苯能快速定量地同胺基基團發生化學反應的性質，而衍生試劑與D-環絲氨酸形成的衍生物具有穩定性強和非常適合反相液相色譜分離的低極性特征。除此之外，該衍生物在長波長紫外區(348nm)有強烈吸收這一特征使本方法的靈敏度和專一性大大提高。衍生化學反應式如下：

通過試驗發現特立齊酮在二甲亞砜(DMSO)中有非常好的溶解性。本發明將用二甲亞砜(DMSO)作為稀釋劑。該分析方法的關鍵點是對分析系統中水份進行嚴格控制。由于分析系統中含有不確定量的水，這些水將使特立齊酮水解產生不確定量的D-環絲氨酸，從而使測定結果偏高、重現性較差。為了確保系統中水份含量恒定，并低于可接受的實驗誤差，本發明在干燥的二甲亞砜(DMSO)反應溶劑加入過量強脫水試劑N，N’-二環己基碳亞胺(DCC)。DCC的脫水機理如下：(本發明提到的DMSO即為二甲亞砜，DCC為N，N’-二環己基碳亞胺)

在無水DMSO溶劑中進行衍生反應能準確的定量特立齊酮中游離狀態的D-環絲氨酸，后繼色譜分離過程中，特立齊酮遇水產生的D-環絲氨酸不會干擾特立齊酮中原來存在的D-環絲氨酸的測定。

本發明采用的技術方案如下：

樣品前處理：

稀釋液，采用干燥DMSO加1％DCC(W/V)，密封于40C放置12h以上備用。衍生液，用稀釋液配制成約2mg/ml的DNFB溶液。標準D-環絲氨酸溶液，用稀釋液精密配制約60ug/ml的標準D-環絲氨酸溶液。標準品衍生：精密加入500ul的標準D-環絲氨酸溶液于2ml的HPLC進樣瓶中，然后精密加入500ul衍生液，放入恒溫烘箱中，40℃放置20min，迅速進樣。樣品衍生：精密稱取約2mg樣品于2ml的HPLC進樣瓶中，然后精密加入500ul稀釋液，再精密加入500ul衍生液，放入恒溫烘箱中，40℃放置20min，迅速進樣。

本發明使用色譜柱為：Agilent?Zorbax?XDB-C182.1mm*50mm3.5um色譜柱。流速1.0ml/min。柱溫40℃。流動相，A：水，B：乙腈，梯度如下：