[發明專利]一種扁座殼孢發酵生產幾丁質酶的培養基及方法

有效

• 申請號: 201210544806.8
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN102994484A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 邱君志;蘇禮超;李小霞;涂潔;宋飛飛;邱云鋒;郭慶豐;何肖云;毛麗慧
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種扁座殼孢發酵生產幾丁質酶的培養基及方法。

背景技術

扁座殼孢(Aschersonia?placenta?Berk.?et?Br.)是子囊菌門、糞菌綱、肉座菌目、麥角菌科、座殼孢屬的一個種，主要寄生在粉虱和介殼上，在南亞和東南亞等地方都有分布。在我國南方等省的自然生境和農業生態系統中造成粉虱群流行病，從而可以控制粉虱類害蟲的發生與危害。

幾丁質酶在微生物中的分布情況，細菌中有粘質沙雷氏菌，環狀芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，斯氏假單孢菌，巨大芽孢桿菌，液化沙雷氏菌，液化腸桿菌，嗜水氣單孢菌等。放線菌中有灰色鏈霉菌，紅色鏈霉菌及其它一些未定種的鏈霉菌。真菌中有溜曲霉，球孢白僵菌，米曲霉和木霉等（關海寧等，2006）。從植物、動物、真菌和細菌中都能獲取幾丁質酶，但由于細菌具有快速生長和易進行基因操作的特性而倍受人們青睞。目前報道的產幾丁質酶細菌類型很多（楊水英等，?2007）。在真菌幾丁質酶相應領域也報道了一些研究結果。肖炎農等對植物線蟲卵寄生真菌淡紫擬青霉(Paecilomyces?lilacinus)幾丁質酶研究，翟逸對萊氏野村菌(Nomuraea?rileyi)CQ031021幾丁質酶的研究，張潔等球孢白僵(Beauveria?bassiana)Bb174以麩皮:蠶蛹粉(4:1)、蛋白胨1g/L作為產酶最適培養基，在7.5?g?培養基中接種3ml液態種子，自然pH下28℃培養2d?,酶活可達最高，為126U/g?(干培養基)。

目前，對蟲生真菌幾丁質酶的應用主要集中在對害蟲的生物防治和幾丁質、殼聚糖等生物資源的開發利用方面。在生物防治方面，主要通過基因工程方法來克隆表達一些具有很強的致病作用的真菌幾丁質酶，或者通過將蟲生真菌幾丁質酶基因構建轉化到植株中來提高植物對蟲害的抗性，在這兩方面都已經取得了較大進展。國內、外已經對很多蟲生真菌的幾丁質酶基因進行了克隆，特別是白僵菌、綠僵菌和蠟蚧菌的幾丁質酶表現出良好的致病性作用。這些研究的目的是為了解決昆蟲病原真菌殺蟲速率緩慢的弱點，以期從分子生物水平上提高菌株的殺蟲毒力，在最大程度上發揮真菌在害蟲控制上的優勢及潛力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種扁座殼孢發酵生產幾丁質酶的培養基及方法。

本發明首先提供了一種扁座殼孢發酵生產幾丁質酶的培養基，所述培養基的原料含有1w%可溶性淀粉或者葡萄糖，1w%蛋白胨或者酵母粉，4×10^-4mol/L?Ba²⁺或者Ca²⁺，0.01w%Vc或者VB₁，培養基初始pH=5.5-7.0。

更優選地，所述培養基的原料按重量分數計，1w%可溶性淀粉，1w%蛋白胨，4×10^-4mol/L?Ba²⁺，0.01w%Vc，培養基初始pH=7.0。

其次，本發明還提供了一種扁座殼孢發酵產幾丁質酶的方法，所述方法包含以下步驟：

（a）將扁座殼孢接種種子培養基，制得發酵種子液；

（b）將步驟（a）中制得的發酵種子液接種于所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26℃，轉速160?r/min下培養。

所述種子培養基的原料含有：200g/L土豆，葡萄糖20g/L，自然pH。

本發明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。

采用本發明優化后的培養基，菌齡4d，發酵周期4d，發酵產生結果扁座殼孢產幾丁質酶的酶活為4.0U/mL以上。

本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發酵生產幾丁質酶的培養基，具有幾丁質酶產率高，幾丁質酶活力高等優點。

附圖說明

圖1?為NAG標準曲線；

圖2?為不同碳源對產酶的影響；

圖3?為不同氮源對產酶活性的影響。

具體實施方式

本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。

實施例1

單因素實驗確定培養基最優成分