[發(fā)明專利]游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位磁微粒化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210544698.4
• 申請日: 2012-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN103076458A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/76
• 分類號(hào): G01N33/76;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位磁微粒化學(xué)發(fā)光定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

1）游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位系列校準(zhǔn)品；2）抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒溶液；3）異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液；4）堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液；5）堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液；6）清洗液濃縮液；以及7）反應(yīng)管。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒的反應(yīng)管所使用的材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液是摩爾濃度為0.1～0.3M?，pH值為8～10的Tris-HCl緩沖液，其包含0.2～0.4mg/mL的二氧雜環(huán)乙烷化合物(APCL)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗液濃縮液為摩爾濃度為0.1～0.2M，pH值為8～9的Tris-HCl緩沖液，其中含有質(zhì)量百分濃度為0.01～0.04%的吐溫20和質(zhì)量百分濃度為15～20%的氯化鈉。

5.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于以下步驟：

1）游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位系列校準(zhǔn)品的制備：用新生牛血清將人絨毛膜促性腺激素β亞單位純品稀釋為系列校準(zhǔn)品，其校準(zhǔn)品濃度范圍為0～200ng/mL；

2）抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備：將粒徑為0.7～3μm的磁微粒加磁場，靜置10～20min,倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進(jìn)行懸浮，濃度為50mg/mL;每mL懸浮液中加入抗FITC多克隆抗體1～3?mg，在室溫條件下混合均勻；用去離子水配制濃度為10mg/?mL的EDC溶液，每mL磁微粒懸浮液中加入1mL濃度為10mg/?mL的EDC溶液，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，加磁場，靜置10～20min,倒出上清液，用pH值為8.0、含有質(zhì)量百分濃度為0.5%的牛血清白蛋白和質(zhì)量百分濃度為0.2%的疊氮化鈉防腐劑的摩爾濃度為0.05~0.2M?的Tris-HCl緩沖液清洗3～5次，得到包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒，并用該緩沖液將包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒配制成濃度為0.5～2μg/mL的抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液；

3）異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液的制備：將游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體置于透析袋，在pH=9.0，摩爾濃度為0.2M的碳酸鹽緩沖液中過夜透析；用摩爾濃度為0.2M的pH=9.0的NaHCO₃溶液配制濃度為0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抗體加入0.15mL濃度為0.5mg/mL的FITC溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)20-24小時(shí)后，在pH=9.0，摩爾濃度為0.2M的碳酸鹽緩沖液中過夜透析，即得Tris-HCl緩沖液稀釋得到的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體，得到濃度為0.25～0.5μg/mL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液；

4）堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體的制備：用去離子水配制13.76mg/mL?的2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，取游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體預(yù)先裝在尖底試管里，加入試管體積1/100的13.76?mg/mL?的2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，混勻，在在室溫下放置30分鐘；計(jì)算所需要的堿性磷酸酶的量，即抗體的量乘以1；用無水N,N-二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL?的Sulfo-SMCC溶液，在含有堿性磷酸酶的反應(yīng)管中加入試管體積1/20的Sulfo-SMCC溶液溶液，混勻，在在室溫下放置15分鐘；將上述活化后的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體中加入試管體積1/500的1M?MgCl2溶液，再加入活化后的堿性磷酸酶溶液，將試管放在4℃條件下14-16小時(shí)；安裝蛋白質(zhì)純化系統(tǒng),使用Superdex?20或類似制備柱，使用pH=7.0去離子水配制的質(zhì)量百分濃度為2%的三乙醇胺溶液進(jìn)行平衡，流速1ml/min，收集各洗脫峰流分，測定各洗脫峰流分的280nm處吸光值,收集280nm處吸光值大于0.02的流份，計(jì)算蛋白濃度(ABS1.0=0.6mg/ml)；用含質(zhì)量百分濃度為0.5%的牛血清白蛋白和質(zhì)量百分濃度為0.2%的疊氮化鈉防腐劑的摩爾濃度為0.1M?的Tris-HCl緩沖液稀釋上述得到的流份，得到濃度為0.25～0.5μg/mL的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液；

5）制備堿性磷酸酶所作用的法學(xué)發(fā)光底物液：向摩爾濃度為0.1～0.3M，pH值為8～10的Tris-HCl緩沖液添加二氧雜環(huán)乙烷化合物(APCL)得到二氧雜環(huán)乙烷化合物的濃度為0.2～0.4mg/mL的化學(xué)發(fā)光底物液；

6）清洗液濃縮液的配制：向摩爾濃度為0.1～0.2M、pH值為8～9的Tris-HCl緩沖液中加入吐溫20和氯化鈉，其中清洗液濃縮液中吐溫20的質(zhì)量百分濃度為0.01～0.04%，氯化鈉的質(zhì)量百分濃度為15～20%；

7）分裝上述游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位系列校準(zhǔn)品、抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液、堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體溶液、堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液、清洗液濃縮液和反應(yīng)管；

8）組裝為成品。