[發明專利]一種鵝細小病毒H株及其在小鵝瘟防治中的應用

有效

• 申請號: 201210543550.9
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103122336A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 藏玉婷;鄔立權;王彬;柴華;王琪;宋揚;王峰;劉洪斌;李尊江;涂映霞;胡瑞鴻;張楊;丁國杰
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/23;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明屬于生物疫苗領域，具體涉及一種鵝細小病毒H株及其在小鵝瘟防治中的應用。

背景技術

小鵝瘟是由鵝細小病毒(GooseParvovirus，GPV)引起的雛鵝急性或亞急性敗血性傳染病。該病是我國學者方定一于1956年首次在江蘇揚州發現，60年代以來,在歐洲、亞洲等國家相繼報道該病的發生與流行。1974年，國際禽病學會(WPSA)正式將該病命名為Derzsys氏病。該病主要侵害出殼后4～20日齡的雛鵝，也感染雛鴨，傳播速度快，發病率和死亡率較高達90%～100%，特別是近年來在我國的一些省、市、自治區均有流行，給養鵝業造成嚴重危害，帶來重大的經濟損失，受到國內外畜牧獸醫工作者的廣泛關注。因此，早期預防對控制本病十分重要。

各種抗菌藥物對小鵝瘟均無治療作用，本病的特異性防治有賴于被動免疫和主動免疫。

發明內容

本發明目的之一是提供一株新分離的鵝細小病毒毒株；

本發明目的之二是將上述鵝細小病毒毒株應用于制備小鵝瘟滅活疫苗；

本發明目的之三是提供一種制備上述小鵝瘟滅活疫苗的方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一株新分離的鵝細小病毒毒株由本發明人自行分離得到，通過毒種的分離培養、電鏡負染觀察、鵝胚中和試驗、病毒的PCR檢測及病毒的測序檢測實驗，確定該毒株為一株新的鵝細小病毒，命名為鵝細小病毒H株（GPV-H），微生物保藏號是：CGMCC?No.6851。分類名是：鵝細小病毒；保藏時間是：2012年11月13日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

本發明鵝細小病毒（GPV）H株的分離結果顯示：病毒盲傳5代，多數鵝胚于72～120h死亡。剖檢鵝胚可見絨毛尿囊膜水腫，胚頭，頸部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血。頭及頸部水腫。收獲的鵝胚尿囊液經紅細胞凝集試驗檢測無血凝活性。

本發明鵝細小病毒（GPV）H株的電鏡負染觀察結果顯示：電鏡照片可見，病毒粒子直徑約為20nm，呈球形，無囊膜，具有典型的細小病毒特征。見附圖1。

本發明鵝細小病毒（GPV）H株的鵝胚中和試驗結果顯示：試驗組鵝胚全部存活，而對照組經5～6d全部死亡，死亡鵝胚出血，水腫。說明小鵝瘟抗血清可中和該病毒。

本發明鵝細小病毒（GPV）H株的病毒的PCR檢測結果顯示：通過小鵝瘟病毒特異性引物和相應的PCR試驗，經1%瓊脂糖凝膠電泳，約在500bp處出現了特異性的DNA條帶。見附圖2。

本發明鵝細小病毒（GPV）H株的測序檢測結果顯示：利用DNA?MAN軟件，將H株VP3基因序列與參考毒株的相應序列進行比較，核苷酸酸同源性在95.9%～99.1%，氨基酸同源性在97.9%～99.6%之間。通過基因進化樹分析可以看出，H株與黑龍江分離到的毒株關系較近。見附圖3、4、5。

進一步的，本發明還提出了所述的鵝細小病毒H株在制備小鵝瘟滅活疫苗中的應用。

本發明的一種小鵝瘟滅活疫苗，其特征在于有效成分為滅活后的鵝細小病毒H株，所述的鵝細小病毒H株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.6851。

更進一步的，本發明還提供了一種制備以上所述的小鵝瘟滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：將所述鵝細小病毒H株進行培養，得到鵝細小病毒抗原液，將鵝細小病毒抗原液滅活、濃縮，分別配制油相和水相，將油相和水相混合后乳化，即得小鵝瘟滅活疫苗。

在本發明中，優選的，所述的抗原液按照以下方法制備：

取所述的鵝細小病毒H株毒種（保藏編號為CGMCC?NO.6851），用滅菌生理鹽水稀釋至10^-3～10^-4，尿囊腔內接種12日齡無小鵝瘟抗體的鵝胚，0.2mL/胚，接種后密封針孔，置37℃孵育，不必翻蛋，雞胚接種后，每天照蛋2次，將72小時前死亡的鵝胚棄去；此后，每4～6小時照蛋1次，死亡的胚隨時取出，直至216小時，將72～216小時死亡鵝胚置于4℃冷卻4～24小時；用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部位卵殼，揭去卵殼膜，挑破絨毛尿囊膜及羊膜，吸取鵝胚尿囊液，即為抗原液。

優選的，進一步的，將得到的抗原液進行5倍濃縮。

在本發明中，優選的，所述的油相按照以下方法制備：白油94份（以毫升為單位）、司本-80?6份（以毫升為單位），混合后加熱，加入硬脂酸鋁2份（以克為單位）混合均勻，即得油相。