[發(fā)明專利]氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210543221.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN102994387A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜文俠;楊玉蘭;劉琦;楊萍;陳寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12Q1/37;C12Q1/04;G01N21/64;G01N21/31
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法，屬于微生物育種、酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一類，它們能從蛋白質(zhì)和多肽鏈的N末端順序水解氨基酸，其催化機(jī)理可以用下式表示：

在生物體內(nèi)，氨肽酶不僅維持著細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于細(xì)胞的成熟、生長和防御都具有重要的作用，還作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、特異性位點(diǎn)的重組因子和毒素受體參與抗生素的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)。氨肽酶的種類多，不同氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基的水解能力不同，即使同一類氨肽酶對(duì)N端不同氨基酸殘基的水解能力也有一定的差異。根據(jù)不同氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基水解的專一性程度不同，可以將氨肽酶分為兩大類：一類氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基專一性低，能水解幾乎所有的氨基酸殘基，如亮氨酸氨肽酶、賴氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶，區(qū)分這類氨肽酶的依據(jù)是它們對(duì)不同氨基酸殘基的水解速度的快慢，如亮氨酸氨肽酶水解末端亮氨酸殘基速度最快，而賴氨酸氨肽酶水解末端賴氨酸殘基速度最快。另一類氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基有嚴(yán)格的專一性，只能特異地水解某一種或幾種氨基酸殘基，如脯氨酸氨肽酶只能水解末端脯氨酸殘基。氨肽酶特有的水解方式和功能，決定了其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、飼料及生物技術(shù)等行業(yè)。

目前氨肽酶制劑主要應(yīng)用于功能肽的制備和蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)加工過程，用以提高營養(yǎng)質(zhì)量，改善產(chǎn)品的風(fēng)味。由于氨肽酶能促進(jìn)不良口感疏水肽的水解、釋放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸，氨肽酶已經(jīng)成為水解蛋白脫苦劑的首選。

隨著發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，微生物發(fā)酵法已成為氨肽酶工業(yè)化生產(chǎn)方法的主流。菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶的物質(zhì)基礎(chǔ)，從自然界篩選并在實(shí)驗(yàn)室誘變進(jìn)化一直是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新工業(yè)微生物菌種的重要途徑。常規(guī)的菌種選育方法工作量大、周期長、效率低、成本高。采用高通量方法篩選新型的氨肽酶和氨肽酶高產(chǎn)菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高篩選速度。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服篩選新型氨肽酶及其高產(chǎn)菌株的常規(guī)方法存在的工作量大、周期長和成本高等問題，本發(fā)明提供了一種基于深孔板的微型化培養(yǎng)與基于酶標(biāo)儀微量化檢測的高通量篩選方法。高通量篩選氨肽酶及其高產(chǎn)菌株方法如下：

挑取氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落，適當(dāng)稀釋菌濃度，接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，每一孔由板號(hào)、行號(hào)和列號(hào)的組合標(biāo)記，使每個(gè)孔有一個(gè)特定的編號(hào)。蓋上深孔板的三明治蓋子，于30～40℃、180～300rpm搖床培養(yǎng)4～10h。將深孔板I深孔中的種子液對(duì)應(yīng)地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II對(duì)應(yīng)的深孔中，蓋上三明治蓋子，于30～40℃、180～300rpm搖床培養(yǎng)16～48h。將深孔板II放置于孔板離心機(jī)，5000～10000×g離心5～30min。深孔板II的深孔中的上清液為粗酶液。以微量化梯度稀釋法將粗酶液適當(dāng)稀釋。在酶標(biāo)板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，加入稀釋的待測粗酶液，以蒸餾水作空白對(duì)照，于30～70℃水浴反應(yīng)10～30min，反應(yīng)結(jié)束立即加入30～50％乙酸溶液終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液的吸光度或熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計(jì)算酶活。根據(jù)酶活測定結(jié)果，選擇對(duì)應(yīng)的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，獲得氨肽酶高產(chǎn)菌株。(見附圖1)

氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落可以來自自然界的含菌樣品，也可以來自出發(fā)菌株的人工誘變的突變株。

采用微量化梯度稀釋法稀釋菌濃度的具體步驟為：用帶濾芯的無菌移液吸頭以8通道移液器，自深孔板的A1～H1孔中吸取0.1mL氨肽酶產(chǎn)生菌的懸液，移至裝有0.9mL無菌生理鹽水的深孔板的A2～H2孔中，振蕩混勻，再用8通道移液器吸取0.1mLA2～H2，對(duì)應(yīng)地移至深孔板A3～H3深孔中，如此逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度。

所述液體種子培養(yǎng)基為：麥芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氫鉀0.5～1.5g/L、硫酸鎂0.1～0.5g/L，pH7.0、0.1MPa滅菌30min。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：麥芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氫鉀0.5～3.0g/L、硫酸鎂0.05～0.5g/L、氯化鈉0.5～1.5g/L，pH6.5～7.5、0.1MPa滅菌30min。