[發明專利]氨肽酶及其高產菌的高通量篩選方法

無效

• 申請號: 201210543221.4
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102994387A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 姜文俠;楊玉蘭;劉琦;楊萍;陳寧
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/37;C12Q1/04;G01N21/64;G01N21/31
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

1.氨肽酶及其高產菌的高通量篩選方法，包括如下步驟：

挑取氨肽酶產生菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養基的深孔板I的孔中，蓋上深孔板的蓋子，于30～40℃、180～300rpm搖床培養4～10h；將深孔板I中的種子液對應地接種到裝有發酵培養基的深孔板II中，于30～40℃、180～300rpm搖床培養16～48h；將深孔板II放置于孔板離心機，5000～10000×g離心5～30min；深孔板II的深孔中的上清液為粗酶液；以微量化梯度稀釋法將粗酶液適當稀釋；用酶標板法測定粗酶液的酶活，在酶標板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，加入稀釋的待測粗酶液，以蒸餾水作空白對照，于30～70℃水浴反應10～30min，反應結束立即加入30～50%乙酸溶液終止反應；采用酶標儀測定反應液的吸光度或熒光強度，根據標準曲線和粗酶液的稀釋倍數計算酶活；根據酶活測定結果，選擇對應的菌株進行搖瓶復篩，獲得氨肽酶高產菌株。

2.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶產生菌的單菌落為自然界的含菌樣品或突變株。

3.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述液體種子培養基為：麥芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氫鉀0.5～1.5g/L、硫酸鎂0.1～0.5g/L、pH7.0、0.1MPa滅菌30min。

4.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述發酵培養基為：麥芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氫鉀0.5～3.0g/L、硫酸鎂0.05～0.5g/L、氯化鈉0.5～1.5g/L、pH6.5～7.5、0.1MPa滅菌30min。

5.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述酶反應所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液、HEPES緩沖液和氨-氯化銨緩沖液之中的一種。所述緩沖液的pH為6.5～8.5；緩沖液濃度為0.02～0.2mol/L。

6.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物是氨基酸對硝基苯胺。

7.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨基酸對硝基苯胺為丙氨酸對硝基苯胺、精氨酸對硝基苯胺、天冬酰胺對硝基苯胺、天冬氨酸對硝基苯胺、半胱氨酸對硝基苯胺、谷氨酰胺對硝基苯胺、谷氨酸對硝基苯胺、組氨酸對硝基苯胺、異亮氨酸對硝基苯胺、甘氨酸對硝基苯胺、亮氨酸對硝基苯胺、賴氨酸對硝基苯胺、甲硫氨酸對硝基苯胺、苯丙氨酸對硝基苯胺、脯氨酸對硝基苯胺、絲氨酸對硝基苯胺、蘇氨酸對硝基苯胺、色氨酸對硝基苯胺、酪氨酸對硝基苯胺或纈氨酸對硝基苯胺。

8.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述熒光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素為下列化合物之一：丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、組氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、異亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、賴氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、絲氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、蘇氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、纈氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。

9.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物溶液濃度為2～20μmol/L，熒光底物溶液濃度2～20nmol/L；顯色底物用于酶活測定比色的波長為360～450nm；熒光底物用于酶活測定的激發光波長為340～400nm，發射光波長為420～480nm。

10.根據權利要求1所述的氨肽酶高產菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶種類的判斷方法如下：若底物為亮氨酸對硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時有較高的酶活，而添加其它氨基酸對硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時無酶活或者酶活較低，則表明所測樣品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物為甲硫氨酸對硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時有較高的酶活，而添加其它氨基酸對硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時無酶活或者酶活較低，則表明所測樣品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此類推。