[發明專利]一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210541795.8
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102988974A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 徐明明;楊靈芝;張靜
• 申請（專利權）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61P31/22;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

技術領域

本發明涉及屬于獸用生物制品培育技術領域，具體涉及一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活苗的方法。

背景技術

偽狂犬病又稱Aujeszky氏病，是由偽狂犬病病毒（Pseudora-bies?virus,PRV）所引起的多種家畜、家禽及野生動物的一種以發熱、流產、奇癢（除豬外）、腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。該病毒歸屬皰疹病毒科（Herpesviridae）甲型皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae?of?alphavirinae），因此也成豬皰疹病毒?型（Suid?herpesvirus??）、傳染性延髓麻痹病病毒或奇癢癥病毒。該病毒的感染譜極廣，以表明有40種動物可以被感染，豬是該病毒的最重要的儲存宿主和帶毒者，因而對該病毒的傳播起著重要的作用。由于被感染動物種類極多，病毒可在自然界反復循環存在，屬于典型的自然疫源性疾病，也是極難防制的傳染病之一。

豬發生偽狂犬病以后，其臨床癥狀取決于感染豬的年齡、病毒株的毒力感染途徑和劑量。成年及母豬主要表現為呼吸癥狀，多呈一過性，是帶毒和排毒的主要來源。可致懷孕母豬流產、產死胎、木乃伊胎兒和種豬不育等綜合癥候群。15日齡以內的仔豬發病死亡率更高達100%，斷奶仔豬發病率可達40%，死亡豬已日益增多。

本病目前尚無特效治療藥物，疫苗的免疫接種是預防和控制偽狂犬病的根本措施，目前國內外已研制出偽狂犬的常規弱毒疫苗、滅活疫苗和基因缺失疫苗，這些疫苗都能在一定程度上減輕或防治偽狂犬病的臨床癥狀，從而減少造成的經濟損失。

但是目前豬偽狂犬病毒活疫苗的制備方法中普遍用原代雞胚成纖維細胞（CEF）培養PRV弱毒的方法，這種方法存在操作過程復雜繁瑣、毒價低、批間差大、生產成本高、大量生產受制于?SPF?蛋的供應，而且容易引入外源病毒或其它污染源、很容易造成疫苗質量不穩定等缺陷。

另外，DF-1?細胞系最早由美國明尼蘇達大學動物科學系?Douglas?Foster??博士于?1998?年改良而成的，起源于?10?日齡的?ELL-0（來航）雞胚成纖維細胞（CEF），是自發永生性的，可以無限繁殖。它有著成纖維細胞的典型的細胞形態。DF-1?細胞逆轉錄酶陰性，沒有禽類肉瘤和白血病病毒的內源性基因序列，所以是非致瘤性的。DF-1?細胞系是經美國食品與藥物管理局（FDA）授權的全球商業化細胞系，目前已被廣泛應用于禽類病毒的增殖、重組蛋白的表達、腫瘤病毒的研究及動物和人類疫苗的生產。?DF-1?細胞對雞傳染性法氏囊病毒、呼腸孤病毒、禽白血病病毒、勞氏肉瘤病毒、火雞皰疹病毒均易感，禽類病毒在?DF-1?細胞上的病變更加劇烈，更加明顯，可以在?DF-1?細胞上進行復制，并且可以形成明顯的細胞病變。DF-1?細胞具有很好的增殖潛力，和雞胚成纖維細胞相比，DF-1?細胞的密度可以比大?4?倍以上。因此，用DF-1細胞生產豬PRV活疫苗是目前的一個主要研究方向。

發明內容

本發明的目的是，針對現有技術的不足而提出一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，該方法利用傳代雞胚成纖維細胞（DF-1）代替原代雞胚成纖維細胞CEF培養PRV弱毒，并對培養工藝進行系統的優化，以克服復雜繁瑣、成本過高，且容易造成疫苗質量不穩定的缺陷。

本發明的技術方案是通過如下步驟來實現的：

（1）先制備原代雞胚成纖維細胞（CEF），在CEF細胞制備后20-28h，將豬偽狂犬病毒（PRV）弱毒株接種原代雞胚成纖維細胞（CEF），得到豬偽狂犬病毒弱毒種毒，收獲的豬偽狂犬病毒弱毒種毒的病毒液，反復凍融3次后按常規方法測病毒的半數感染量（TCID₅₀）應達到10^7.0TCID₅₀/ml以上。

（2）制備傳代雞胚成纖維細胞(DF-1)細胞單層，將DF-1細胞用含8%血清的DMEM培養基進行馴化，放置于37℃，CO₂含量為5%的恒溫培養箱中培養。其中所述的DMEM培養基中含1.5g碳酸氫鈉/升，PH調到7.0-7.2。

（3）當DF-1細胞傳代后約40～48h，細胞密度為90-100%單層時，將制備的PRV弱毒種毒按0.8%～1%（v/v）的接種劑量接種到DF-1細胞單層，加入含2%血清的DMEM培養基，繼續放置于37℃，CO₂含量為5%的恒溫培養箱中繼續培養。其中所述的DMEM培養基中含1.5g碳酸氫鈉/升，PH調到7.0-7.2。