[發明專利]一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210541795.8
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102988974A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 徐明明;楊靈芝;張靜
• 申請（專利權）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61P31/22;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

1.一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于培養方法及步驟如下：

（1）先制備原代雞胚成纖維細胞（CEF），在CEF細胞制備后20-28h，將豬偽狂犬病毒（PRV）弱毒株接種原代雞胚成纖維細胞（CEF），得到豬偽狂犬病毒弱毒種毒；

（2）制備傳代雞胚成纖維細胞(DF-1)細胞單層，將DF-1細胞用8%血清的DMEM

DMEM培養基進行馴化，放置于37℃，CO₂含量為5%的恒溫培養箱中培養；

（3）當DF-1細胞傳代后40～48h，細胞密度為90-100%單層時，將制備的PRV弱毒種毒按0.8%～1%（v/v）的接種劑量接種到DF-1細胞單層，加入含2%血清的DMEM培養基，放置于37℃，CO₂含量為5%的恒溫培養箱中繼續培養；

（4）接種病毒后DF-1細胞會產生細胞病變，觀察細胞病變，當細胞病變達到85%時，收獲病毒液；

（5）將收獲的病毒液按1:1的比例與凍干保護劑混合，經真空冷凍凍干，即成豬偽狂犬活疫苗。

2.根據權利要求1所述的一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于：步驟（1）收獲的豬偽狂犬病毒弱毒種毒的病毒液，反復凍融3次后按常規方法測病毒的半數感染量（TCID₅₀）達到10^7.0TCID₅₀/ml以上。

3.根據權利要求1所述的一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于：所述的DMEM培養基為國內清大天一的DMEM培養基，其中含1.5g碳酸氫鈉/升，DMEM培養基調PH到7.0-7.2。

4.根據權利要求1中所述的一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于：其中步驟（2）、（3）中所述的血清為國產血清，選為杭州四季青胎牛血清、武漢三利胎牛血清、蘭州民海優級新生牛血清和濟南勁牛新生牛血清中至少一種。

5.根據權利要求1所述的一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于：步驟（5）中，所述的凍干保護劑中每100ml含有5g蔗糖和10g的脫脂奶粉。

6.根據權利要求1或2中所述的一種用傳代雞胚成纖維細胞制備豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于：所述的豬偽狂犬弱毒株為Bartha?K61毒株。