[發明專利]檢測鄰苯二甲酸二丁酯的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210541505.X
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103869070A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 何方洋;萬宇平;馮才偉;孫震;楊昌松;李勇;崔廷婷;楊學林
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/544
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測鄰苯二甲酸二丁酯的酶聯免疫試劑盒，其特別適于白酒中鄰苯二甲酸二丁酯含量的檢測。

背景技術

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）屬于鄰苯二甲酸酯類，是目前國內外工業生產中使用最多的塑化劑（又稱增塑劑），廣泛存在于食品包裝、化妝品、醫療器材以及環境水體中。這類塑化劑并非食品或食品添加物，但會通過環境遷移、食品包裝遷移及非法添加等進入食品，對人體健康產生毒害作用，如造成內分泌失調，影響正常生育能力，在體內長期蓄積會導致畸形、癌變和突變，對心血管、消化和泌尿系統也有很大傷害。因此，我國衛生部衛辦監督函〔2011〕551號文件中規定：嚴禁在食品、食品添加劑中人為添加鄰苯二甲酸酯類物質，食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二（α-乙基已酯）（DEHP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）和鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）最大殘留量分別為1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。

目前文獻報道有關鄰苯二甲酸酯類物質的檢測方法有氣相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法、氣相色譜-離子阱質譜法等。但研究大多集中于環境樣品和塑料包裝材料，對于食品中的污染情況檢測研究較少。我國食品中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T?21911-2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》”，包裝中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T?21928-2008《食品塑料包裝材料中鄰苯二甲酸酯的測定》”，兩種檢測方法均運用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）的方法進行測定。該方法靈敏、準確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制了其應用。與之相比，酶聯免疫方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測等優點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國食品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。

發明內容

本發明的目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于鄰苯二甲酸二丁酯檢測的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗體、酶標記物、鄰苯二甲酸二丁酯標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、樣本稀釋液，所述包被原為鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。

所述鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原是由鄰苯二甲酸二丁酯半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原是由鄰苯二甲酸酐與正丁醇、4-氨基丁酸反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗體可為鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體或鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體，其中優選鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體。

所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，其中優選羊抗鼠抗抗體。

所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括鄰苯二甲酸二丁酯標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、樣本稀釋液。

所述鄰苯二甲酸二丁酯標準品溶液6瓶，濃度分別為0mg/L、0.02mg/L、0.06mg/L、0.18mg/L、0.54mg/L、1.62mg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1~2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1~2mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01‰~0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1~0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

所述樣本稀釋液優選為pH值為7.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。