[發明專利]突變噬菌體E基因、含該基因的打孔質粒載體及其在制備疫苗中的應用

有效

• 申請號: 201210541108.2
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103045614A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 徐家華;陳瑞愛;張東霞;湯欽;黃妙容
• 申請（專利權）人: 肇慶大華農生物藥品有限公司;廣東大華農動物保健品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/74;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/92;C12R1/42;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術領域

本發是明涉及一種經基因突變后獲得的PhiX174噬菌體E基因的DNA及其制備方法，還涉及含有該DNA的打孔質粒載體，還進一步涉及該打孔質粒載體在制備疫苗菌脫中的應用，屬于生物基因工程領域。

背景技術

在細菌中表達PhiX174噬菌體E裂解基因，能夠通過滲透壓的作用使細菌的細胞膜破裂，造成細菌細胞內的胞漿和核酸成分流出，而形成一種空的細菌外殼，即為“bacterial?ghost”(菌脫)。由于菌脫和活菌具有一樣的細菌膜結構擔保和相關抗原蛋白，與通過甲醛等化學方法滅活的細菌比較其刺激機體產生免疫反應的抗原物質未發生變性，因此菌脫是良好的候選疫苗。目前E蛋白介導的溶解已經成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎少門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、支氣管敗血博德特氏桿菌等。但是，如果菌脫作為疫苗使用，尤其是對于強致病性細菌時，此時就需要菌脫中不含活菌，否則在使用菌脫免疫動物時，容易造成動物因感染強致病性活菌而發病。雖然菌脫已經廣泛應用于革蘭氏陰性菌中，對于Top10、DH5a等基因工程大腸桿菌的裂解效果較好，而對于野生型大腸桿菌或者其革蘭氏陰性菌的裂解效果一般。因此，有必要提高E基因的裂解效果。

禽沙門氏菌病在世界各地普遍存在，對養禽業的危害性很大。提高E基因對禽沙門氏菌的裂解效果，有利于增加禽沙門氏菌菌脫作為候選疫苗的可能性。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種突變噬菌體E基因；

本發明的目的之二在于提供上述突變噬菌體E基因的制備方法；

本發明的目的之三在于提供含上述突變噬菌體E基因的打孔載體；

本發明的目的之四在于構建含上述突變噬菌體E基因的打孔載體的方法；

本發明的目的之五在于將上述突變噬菌體E基因應用于制備禽沙門氏菌菌脫疫苗。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種突變噬菌體E基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。該突變噬菌體E基因相對于PhiX174噬菌體E基因在禽少門氏菌中的表達量大大提高。

一種突變噬菌體E基因的制備方法，其特征在于順次包括以下步驟：

1）通過引物1（SEQ?ID?NO：3）和引物2（SEQ?ID?NO：4）進行PCR擴增獲得PhiX174噬菌體E基因并測序，其序列為SEQ?ID?NO：2所示；

2）對序列為SEQ?ID?NO：2所示的E基因進行點突變，E基因點突變后的序列為SEQ?ID?NO：1所示。

將本發明的突變噬菌體E基因與pMD18-T等可操作性載體連接，即可得到打孔載體。

具體地，一種構建含上述突變噬菌體E基因的打孔載體的方法，使用引物3（SEQ?ID?NO：5）和引物4（SEQ?ID?NO：6）將上述的突變噬菌體E基因與pMD18-T載體相連接。

一種制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）在含氨芐青霉素的LB中接種含權上述突變噬菌體E基因的打孔載體的基因工程大腸桿菌，培養后提取表達載體質粒；

2）使用電極儀或者氯化鈣轉化法把表達載體質粒轉入禽沙門氏菌中，在含氨芐青霉素的LB固體培養板中培養，通過PCR鑒定并挑取含表達載體質粒的陽性禽沙門氏菌；

3）誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達；

4）收集溶菌結束后形成的禽沙門氏菌菌脫，用純水洗滌，-20℃保存。

優選地，步驟1）所述表達載體質粒通過如下方法獲得：把突變噬菌體E基因與pMD18-T載體相連接，然后轉入Top感受態細胞，并取100ul該培養液均勻涂布于含氨芐青霉素100ug/mL的LB瓊脂平板上，放入37℃培養箱；等培養板干了之后，倒置培養10-14h，挑白色單菌落進行擴大培養，并提取質粒；使用Sac?I和BamH?I對含有突變噬菌體E基因的質粒進行雙酶切；突變噬菌體E基因的雙酶切產物與使用Sac?I和BamH?I雙酶切后的化學誘導型表達載體或溫控型表達載體連接在一起，然后轉入Top感受態細胸，挑取陽性菌落，擴大培養后提取質粒，即獲得化學誘導型表達載體質?；驕乜匦捅磉_載本質粒。

優選地，步驟3）誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達可通過下面兩種方法進行：

a)化學誘導型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達：當禽沙門氏菌濃度OD值達到0.3時，加入0.5M的IPTG在37℃的溫度下進行誘導培養；

b)溫控型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達：當禽沙門氏菌濃度OD值達到0.3時，在42℃的溫度下進行誘導培養。