[發(fā)明專利]突變噬菌體E基因、含該基因的打孔質(zhì)粒載體及其在制備疫苗中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210541108.2
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103045614A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐家華;陳瑞愛;張東霞;湯欽;黃妙容
• 申請（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/74;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/92;C12R1/42;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.突變噬菌體E基因，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。

2.一種權(quán)利要求1所述的突變噬菌體E基因的制備方法，其特征在于順次包括以下步驟：

1）通過序列為SEQ?ID?NO：3所示的引物1和序列為SEQ?ID?NO：4所示的引物2進行PCR擴增獲得PhiX174噬菌體E基因并測序，其序列為SEQ?ID?NO：2所示；

2）對序列為SEQ?ID?NO：2所示的E基因進行點突變，E基因點突變后的序列為SEQ?ID?NO：1所示。

3.含權(quán)利要求1所述的突變噬菌體E基因的打孔載體。

4.如權(quán)利要求3所述的打孔載體，其特征在于：該打孔載體是將權(quán)利要求1的突變噬菌體E基因與pMD18-T載體可操作性相連接得到的。

5.一種構(gòu)建權(quán)利要求4所述的含突變噬菌體E基因的打孔載體的方法，其特征在于：使用序列為SEQ?ID?NO：5所示的引物3和序列為SEQ?ID?NO：6所示的引物4將權(quán)利要求1的突變噬菌體E基因與pMD18-T載體相連接。

6.一種制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）在含氨芐青霉素的LB中接種含權(quán)利要求3的打孔載體的基因工程大腸桿菌，培養(yǎng)后提取表達載體質(zhì)粒；

2）使用電極儀或者氯化鈣轉(zhuǎn)化法表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入禽沙門氏菌中，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板中培養(yǎng)，通過PCR鑒定并挑取含表達載體質(zhì)粒的陽性禽沙門氏菌；

3）誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達；

4）收集溶菌結(jié)束后形成的禽沙門氏菌菌脫，用純水洗滌，－20℃保存。

7.如權(quán)利要求6所述的制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于：步驟1）

所述表達載體質(zhì)粒通過如下方法獲得：把突變噬菌體E基因與pMD18－T載體相連接，然后轉(zhuǎn)入Top感受態(tài)細胞，并取100ul該培養(yǎng)液均勻涂布于含氨芐青霉素100ug/mL的LB瓊脂平板上，放入37℃培養(yǎng)箱；等培養(yǎng)板干了之后，倒置培養(yǎng)10－14h，挑白色單菌落進行擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；使用Sac?I和BamH?I對含有突變噬菌體E基因的質(zhì)粒進行雙酶切；突變噬菌體?E基因的雙酶切產(chǎn)物與使用Sac?I和BamH?I雙酶切后的化學誘導型表達載體或溫控型表達載體連接在一起，然后轉(zhuǎn)入Top感受態(tài)細胸，挑取陽性菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即獲得化學誘導型表達載體質(zhì)粒或溫控型表達載本質(zhì)粒。

8.如權(quán)利要求6或7所述的制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于：步驟3）誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達可通過下面兩種方法進行：

a)化學誘導型表達載體質(zhì)粒在在禽沙門氏菌中表達：當禽沙門氏菌濃度OD值達到0.3時，加入0.5M的IPTG在37℃的溫度下進行誘導培養(yǎng)；

b)?溫控型表達載體質(zhì)粒在在禽沙門氏菌中表達：當禽沙門氏菌濃度OD值達到0.3時，在42℃的溫度下進行誘導培養(yǎng)。