[發明專利]睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶基因增強菌株構建及應用

無效

• 申請號: 201210540987.7
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103074360A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 于源華;王保學;于化東;李艷紅;王妍
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;A62D3/02;C12R1/01;A62D101/28
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

技術領域

本發明屬于應用環境微生物領域。

背景技術

睪丸酮叢毛單胞菌是革蘭氏陰性菌，偏端叢生鞭毛，運動，在自然界中分布廣泛。該菌是好氣不發酵，化能有機營養型的細菌，能夠以睪丸酮、膽固醇、雌三醇等甾體激素作為唯一的碳源及能源。

3，17β-HSD是睪丸酮叢毛單胞菌（C.testosteroni）中降解類固醇等物質的系列酶中的關鍵酶，然而對于其基因結構及功能未進行研究，?國內未見報道。尤其是在C.testosteroni以及假單胞桿菌中未見報道。

Tac?promoter為在大腸桿菌中具有功能的trp-lac雜合啟動子，其-20區上游轉錄起始點的DNA序列來源于trp啟動子,-20區下游的DNA序列來源于lac?UV5啟動子。Tac?promoter比去阻遏的母本lac?UV5啟動子有效地提高轉錄速率大約11倍；比在沒有trp抑制子存在的trp啟動子轉錄速率大約提高3倍。

發明內容

本發明的目的是：提供一種睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶基因增強菌株構建及應用，它利用基因同源重組技術，在睪丸酮叢毛單胞菌基因組中同源插入Tac?promoter與3，17β-羥基類固醇脫氫酶（3，17β-HSD）基因順向連接的DNA片段構建睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株，對于雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率較野生型睪丸酮叢毛單胞菌對于雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率分別提高30%、15%和150%，從而在環境修復中具有重大的應用價值。

本發明的技術方案是：

重組質粒為pK-Tac?promoter-3，17β-HSD；

1.以睪丸酮叢毛單胞菌基因組為模板，通過PCR技術擴增3，17β-HSD基因片段，回收、純化目的片段后，與上海生物工程有限公司的pUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，采用氨芐青霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆菌株，送往公司測序，比對分析確保獲得與模版序列完全匹配的3，17β-HSD基因重組質粒3，17β-HSD-T。

2.?以質粒pAH10為模板，通過PCR技術擴增Tac?promoter基因片段，回收、純化目的片段后，與上海生物工程有限公司的pUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，采用氨芐青霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆菌株，送往公司測序，比對分析確保獲得與模版序列完全匹配的Tac?promoter基因重組質粒Tac?promoter-T。

3.采用上海生工柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質粒3，17β-HSD-T，采用EcoR?I與Xba?I分別對pK18質粒與3，17β-HSD-T質粒進行雙酶切，然后分別回收目的片段，在T4?DNA連接酶的作用下進行連接，構建重組質粒pK-3，17β-HSD。

4.?采用上海生工柱式質粒DNA小量抽提試劑盒分別提取重組質粒Tac?promoter-T與pK-3，17β-HSD，采用Sal?I與Xho?I分別對Tac?promoter-T質粒與pK-3，17β-HSD質粒進行雙酶切，然后分別回收目的片段，在T4?DNA連接酶的作用下進行連接，構建基因增強質粒pK-Tac?promoter-3，17β-HSD。

5.采用電擊轉化技術使基因增強質粒pK-Tac?promoter-3，17β-HSD進入野生型睪丸酮叢毛單胞菌中進行同源重組，構建睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株，并以野生型睪丸酮叢毛單胞菌為對照，進行甾體激素降解分析，利用高效液相色譜分析發現睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株對雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率分別提高30%、15%、150%。

本發明的有益效果是：首次構建基于Tac?promoter的睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株，并對它進行了應用，進行高效液相色譜分析。實驗結果分析發現：睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株對于雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率較野生型睪丸酮叢毛單胞菌對于雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率分別提高30%、15%和150%，該基因增強菌株的構建對降解環境中雌三醇、膽固醇、睪丸酮及其衍生物具有極大的價值，同時對今后研究睪丸酮叢毛單胞菌中3，17β-HSD的功能奠定基礎。

附圖說明

圖?1睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強同源質粒的構建示意圖；

圖?2睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株的構建示意圖；

圖?3睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株的陽性篩選電泳圖；