[發明專利]睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶基因增強菌株構建及應用

無效

• 申請號: 201210540987.7
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103074360A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 于源華;王保學;于化東;李艷紅;王妍
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;A62D3/02;C12R1/01;A62D101/28
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

1.一種睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶基因增強菌株構建，其特征是：重組質粒為pK-Tac?promoter-3，17β-HSD；

a.以睪丸酮叢毛單胞菌基因組為模板，通過PCR技術擴增3，17β-HSD基因片段，回收、純化目的片段后，與pUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，采用氨芐青霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆菌株，測序，比對分析確保獲得與模版序列完全匹配的3，17β-HSD基因重組質粒3，17β-HSD-T；

b.?以質粒pAH10為模板，通過PCR技術擴增Tac?promoter基因片段，回收、純化目的片段后，與pUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，采用氨芐青霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆菌株，測序，比對分析確保獲得與模版序列完全匹配的Tac?promoter基因重組質粒Tac?promoter-T；

c.采用柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質粒3，17β-HSD-T，采用EcoR?I與Xba?I分別對pK18質粒與3，17β-HSD-T質粒進行雙酶切，然后分別回收目的片段，在T4?DNA連接酶的作用下進行連接，構建重組質粒pK-3，17β-HSD；

d.?采用柱式質粒DNA小量抽提試劑盒分別提取重組質粒Tac?promoter-T與pK-3，17β-HSD，采用Sal?I與Xho?I分別對Tac?promoter-T質粒與pK-3，17β-HSD質粒進行雙酶切，然后分別回收目的片段，在T4?DNA連接酶的作用下進行連接，構建基因增強質粒pK-Tac?promoter-3，17β-HSD。

2.如權利要求1所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶基因增強菌株構建的應用，其應用是：

采用電擊轉化技術使基因增強質粒pK-Tac?promoter-3，17β-HSD進入野生型睪丸酮叢毛單胞菌中進行同源重組，構建睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株，并以野生型睪丸酮叢毛單胞菌為對照，進行甾體激素降解分析，利用高效液相色譜分析發現睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-HSD基因增強菌株對雌三醇、膽固醇、睪丸酮的降解效率分別提高30%、15%、150%。