[發明專利]一種生物法合成木糖酸的方法

在審

• 申請號: 201210539717.4
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103865959A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 咸漠;曹玉錦;劉煒
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12P7/58
• 分類號: C12P7/58;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

技術領域

本發明涉及一種合成木糖酸的重組工程受體菌，優選一種合成木糖酸的重組工程大腸桿菌。

本發明還涉及用上述重組工程受體菌(優選，重組工程大腸桿菌)合成木糖酸的方法。

背景技術

木糖酸是一種重要的化工中間體，不僅可用于合成多種化工產品，還可用作高效水泥粘結劑，其粘結效率是現有粘結劑的兩倍以上。在美國能源部的報告中，木糖酸被列為30種最有前景的生物煉制產品之一。

傳統的木糖酸主要通過化學法催化木糖氧化合成，常見的途徑主要包括碘催化法和鈀催化法：(1)在強堿性環境下，以甲醇作溶劑用碘進行氧化木糖，可以保護羥基不被氧化掉，只有將醛基氧化成羧基，得到木糖酸鹽，向溶于甲醇的木糖酸鉀鹽中滴加濃硫酸，才可以得到木糖酸晶體；該方法需要大量使用碘和濃硫酸，容易造成嚴重的環境污染。(2)采用活性炭負載5％的鈀作為催化劑，在溫度為35-50℃、pH＝10.0的條件下，4g的催化劑可以催化含有20g木糖的水溶液生成木糖酸(Chun?et?al.，2006?Applied?Biochemistry?and?Biotechnology，6：654-658)；該方法可以在常溫下進行，且選擇性較好，但需要貴金屬鈀作為催化劑，限制了其商業化應用。上述瓶頸問題阻礙了木糖酸合成的發展，因此尋找綠色經濟的木糖酸合成途徑勢在必行。

生物催化因其反應條件溫和，環境友好已成為化工領域的發展趨勢。采用微生物催化木糖生成木糖酸已經得到了較為廣泛深入的研究。早在上世紀80年代，就有研究者先后分離到了莓實假單胞菌(Buchert?et?al.，1986，Biotechnology?Letters，8：541-516)、氧化葡萄糖酸桿菌(Buchert?et?al.，1988，Applied?Microbiology?and?Biotechnology，29：375-379)等可用用于合成木糖酸的菌株。中國發明專利(201210191920.7)也公開了一種利用氧化葡萄糖酸桿菌高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法。然而這些研究都是利用自然界中存在的天然菌株進行合成，但是，天然菌株存在培養周期長、培養條件苛刻等缺點，無法進行大規模的商業化應用。利用基因工程手段構建工程菌進行生物合成，將有利于生物轉化的規模放大和產業推廣。

木糖生物轉化為木糖酸的代謝途徑包括兩個步驟，：第一步是木糖經木糖脫氫酶催化生成木糖酸內酯，第二步是木糖酸內酯水解生成木糖酸(見圖1)。催化這兩步反應的酶已經從多種微生物中分離得到，其中來自新月柄桿菌(Caulobacter?crescentus)的木糖脫氫酶和木糖酸內酯酶已經得到了較為詳細的研究(Stephens?et?al.，Journal?of?Bacteriology，2007，189：2181-2185)，通過將上述木糖脫氫酶導入不同的宿主體系，研究者已經成功在釀酒酵母(Toivari?et?al.，2012，Metabolic?Engineering，14：427-36)、乳酸克魯維酵母(et?al.，2011，Metabolic?Engineering，13：383-91)建立了木糖酸合成系統。上述酵母體系均為真核表達系統，其生長速率慢，培養基要求高，從而造成這些系統的生產木糖酸的成本過高，無法工業化應用。工程大腸桿菌具有生長速度快、發酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點，因此工程大腸桿菌作為生物催化劑已成為近年來生產生物基化學品的有效手段。Liu等在利用基因工程大腸桿菌生產木糖酸方面已有初步的探索(2012，Bioresource?Technology，115：244-248)，但是該研究獲得的產物為木糖酸內酯而非木糖酸，制約了下游的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生物法轉化D-木糖直接生成木糖酸的方法。

為實現該目標，在第一方面中，本發明提供一種重組工程受體菌菌株，所述受體菌菌株包含木糖脫氫酶基因片段(即，xylB基因片段)和木糖酸內酯酶基因片段(即，xylC基因片段)，能夠將D-木糖轉化為木糖酸。

其中，所述xylB基因片段選自：

(1)來源于新月柄桿菌(Caulobacter?crescentus)的xylB基因(Genbank登記號為：NACL94329)，

(2)與新月柄桿菌的xylB基因同源性超過70％且編碼具有相同或相似的木糖脫氫酶功能的蛋白的核酸序列，或