[發(fā)明專利]一種生物法合成木糖酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210539717.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN103865959A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 咸漠;曹玉錦;劉煒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號(hào): C12P7/58
• 分類號(hào): C12P7/58;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

1.一種生物催化D-木糖合成木糖酸的方法，所述方法包括下述步驟：

A)構(gòu)建能夠?qū)-木糖轉(zhuǎn)化為木糖酸的重組工程受體菌菌株，所述重組工程受體菌菌株包含木糖脫氫酶基因xylB基因片段和木糖酸內(nèi)酯酶基因xylC基因片段；

B)利用A)中所述重組工程受體菌在包含D-木糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑誘導(dǎo)，經(jīng)過分離純化后即獲得木糖酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟A)所述xylB基因片段選自：

(1)來源于新月柄桿菌(Caulobacter?crescentus)的xylB基因，

(2)與新月柄桿菌的xylB基因同源性超過70％且編碼具有相同或相似的木糖脫氫酶功能的蛋白的核酸序列，或

(3)來源于其它生物體，和xylB基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似的木糖脫氫酶功能的蛋白的核酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟A)所述xylC基因片段選自：

(1)來源于新月柄桿菌的xylC基因，

(2)與新月柄桿菌的xylC基因同源性超過70％且編碼具有相同或相似的木糖酸內(nèi)酯酶功能的蛋白的核酸序列，或

(3)來源于其它生物體，和xylC基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似的木糖酸內(nèi)酯酶功能的蛋白的核酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟A)將xylB基因片段和xylC基因片段可操作性地連接共同構(gòu)建在載體上，形成重組質(zhì)粒，然后將所形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌中形成所述重組工程受體菌菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述載體為pACYCduet-1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟A)所用的受體菌為能夠表達(dá)T7RNA聚合酶的宿主體系，例如，大腸桿菌，所述大腸桿菌例如大腸桿菌菌株BL21(DE3)、BL21star(DE)、DH5α(DE3)或JM109(DE3)，其中，優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)受體菌為大腸桿菌時(shí)，步驟B)所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30-37℃、攪拌速度400-800rpm、pH6.5-7.5和溶氧20％以上的條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀約為12-20，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.1-1.0mmol·L^-1，同時(shí)加入D-木糖至30g/L，繼續(xù)補(bǔ)料40％的葡萄糖發(fā)酵24-48小時(shí)。

8.一種重組工程受體菌菌株，所述受體菌菌株包含木糖脫氫酶基因xylB基因片段和木糖酸內(nèi)酯酶基因xylC基因片段。

9.權(quán)利要求8所述的重組工程受體菌菌株，其中所述xylB基因片段選自：

(1)來源于新月柄桿菌的xylB基因，

(2)與新月柄桿菌的xylB基因同源性超過70％且編碼具有相同或相似的木糖脫氫酶功能的蛋白的核酸序列，或

(3)來源于其它生物體，和xylB基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似的木糖脫氫酶功能的蛋白的核酸序列；

所述xylC基因片段選自：

(1)來源于新月柄桿菌的xylC基因，

(2)與新月柄桿菌的xylC基因同源性超過70％且編碼具有相同或相似的木糖酸內(nèi)酯酶功能的蛋白的核酸序列，或

(3)來源于其它生物體，和xylC基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似的木糖酸內(nèi)酯酶功能的蛋白的核酸序列。

10.權(quán)利要求8所述的重組工程受體菌菌株，其中所述受體菌為能夠表達(dá)T7RNA聚合酶的宿主體系，例如，大腸桿菌，所述大腸桿菌例如大腸桿菌菌株BL21(DE3)、BL21star(DE)、DH5α(DE3)或JM109(DE3)，其中，優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。