[發明專利]一種固定化酶及制備方法

無效

• 申請號: 201210537509.0
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103013971A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 吳松海;臧金金;任海濤;韓煦;劉勇
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于材料改性及生物化工領域，涉及一種固定化酶及制備方法。

背景技術

固定化酶指經物理或化學方法處理后，使酶變成不易隨水流失，即運動受限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。與游離酶相比，固定化酶的優點有：可多次使用，且酶的穩定性高；反應后，固定化酶易與底物和產物分離；反應條件易于控制，有利于自動化生產。

殼聚糖是一種自然界中的天然多糖,其資源量僅次于自然界中含量最為豐富的纖維素。其化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，它是甲殼素的重要衍生物。而甲殼素主要來源于節肢動物、軟體動物、環節動物、原生動物、腔腸動物、海藻及真菌等生物體，每年在地球上的自然生成量達十億噸之多。由于殼聚糖的生物親和性高、可用于化學修飾的基團多、親水性強、易交聯成形、無毒對環境友好等特點，它作為固定化酶載體的研究很早就引起了很多學者的重視。但是至今為止，由于合成的殼聚糖固定化酶的機械強度低，易磨損等特點，限制了其在實際生產中的應用。

聚乙烯醇是一種水溶性高分子材料，這種材料廉價易得。而且動物實驗表明，其完全無害，無毒性，無刺激性并且有良好的生物相容性，能夠在體內緩慢降解，廣泛應用于制備止血纖維、人工皮膚，還可以用于代血漿、眼藥膜等，也可以作為藥物緩釋載體材料制備靶向微球或者用來制備固定化酶載體。將酶包埋于聚乙烯醇小球中，制成固定化酶是現在常用的一種固定化酶方法。

聚乙烯醇與殼聚糖相比，有著機械強度高，耐磨性強的特點，但是殼聚糖又有著可修飾基團多的優點。所以，將這兩種材料復合，形成一種兼有兩者優點的復合材料，并將其用于固定化酶，受到了很多研究人員的關注。但是，迄今為止，文獻報道的復合材料都是簡單的物理作用力連接的，材料的機械強度、物理化學穩定性差。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種酶載量高，穩定性好的固定化酶。

本發明的第二個目的是提供一種固定化酶的制備方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種固定化酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)按比例將10g平均聚合度為1750±50的聚乙烯醇加入100-150mL水中，攪拌下加熱至75-85℃，保溫1.5-2.5h，加入1-5mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷，再滴加1-2mL、濃度為1mol/L鹽酸水溶液，攪拌0.5-2.5h，得到改性聚乙烯醇的溶液；

(2)按比例將50mL所述改性聚乙烯醇溶液與50-250mL殼聚糖溶液混合，攪拌1-2h，抽真空除去溶液中的氣泡，得到均相的混合液，將30mL所述均相混合液滴于100-150mL氫氧化鈉溶液中，固化1-3h，用蒸餾水洗至中性，過濾，得到復合小球載體；

所述殼聚糖溶液是用下述方法制成：將1-4g脫乙酰度≥85%的殼聚糖加入100mL水中，在攪拌下加入1-3mL冰醋酸，繼續攪拌2-3h，得到殼聚糖溶液；

所述氫氧化鈉溶液是用下述方法制成：將6-12g氫氧化鈉溶解于100mL水中，再加入20mL乙醇混合均勻；

(3)按比例將4g所述復合小球載體置于20-50mL、質量濃度為1%-5%的戊二醛-緩沖液溶液中，震蕩活化1-5h，用緩沖液洗3-5次，除去未反應的戊二醛，得到活化后的載體小球；

(4)按比例將4g所述活化后的載體小球置于10-50mL、濃度為0.25-1.25mg/mL的酶-緩沖液溶液中，震蕩10-20h，用緩沖液洗3-5次，除去未交聯的酶，得到的固定化酶小球真空凍干；

所述緩沖液為pH=7.0的磷酸鹽緩沖液。

步驟（1）優選為：按比例將10g平均聚合度為1750±50的聚乙烯醇加入125mL水中，攪拌下加熱至80℃，保溫2h，加入3mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷，再滴加1.5mL、濃度為1mol/L鹽酸水溶液，攪拌1.5h，得到改性聚乙烯醇的溶液。

步驟（2）優選為：按比例將50mL所述改性聚乙烯醇溶液與150mL殼聚糖溶液混合，攪拌1.5h，抽真空除去溶液中的氣泡，得到均相的混合液，將30mL所述均相混合液滴于125mL氫氧化鈉溶液中，固化2h，用蒸餾水洗至中性，過濾，得到復合小球載體；

所述殼聚糖溶液是用下述方法制成：將3g脫乙酰度≥85%的殼聚糖加入100mL水，在攪拌下加入2mL冰醋酸，繼續攪拌2.5h，得到殼聚糖溶液；

所述氫氧化鈉溶液是用下述方法制成：將9g氫氧化鈉溶解于100mL水中，再加入20mL乙醇，混合均勻。