[發(fā)明專利]乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210537143.7
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103864903A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 才蕾;任艷娜;唐時幸;王繼華
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C07K14/02
• 分類號: C07K14/02;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/558;A61K39/29;A61P31/20
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法，及其在免疫層析分析領(lǐng)域中的應用。

技術(shù)背景

乙型肝炎病毒（HBV）是一種DNA病毒，它的感染是一個世界性的公共衛(wèi)生問題，中國有約1.3億慢性乙肝病毒攜帶者，其中乙肝表面抗原的攜帶率約10%，每年約有30萬人最終死于乙肝有關(guān)的慢性疾病，是慢性傳染病中的頭號殺手。慢性HBV感染患者主要表現(xiàn)為肝損傷以及脂肪變性和纖維化相關(guān)的代謝紊亂，長期感染患者還可能發(fā)展成為肝硬化和肝細胞癌。乙型肝炎的治療可分為兩大類：一類是抗病毒治療。抗病毒治療主要是α干擾素和核苷類藥物，干擾素主要刺激細胞介導的免疫反應來抑制HBV，同時通過攻擊靶細胞而消除病毒；核苷類藥物可以通過抑制HBV的復制控制病毒的增殖。另一類是免疫治療。主要是宿主針對受病毒感染的干細胞的免疫反應和引起炎癥的細胞因子的介導的，免疫治療可以打破免疫耐受狀態(tài)，誘導機體有效的機體免疫，抑制并清除病毒。這兩種治療均有一定的療效，但在治療的整個過程中要定期檢測體內(nèi)的病毒標志物（HBsAg、HBeAg、抗-HBe和HBV-DNA）的水平，以及時調(diào)整治療方案。因此，乙肝有關(guān)的慢性疾病的診斷和監(jiān)控是當前我國亟待解決的重大課題之一。

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒（HBV）外殼的一種結(jié)構(gòu)成分，在病毒吸附至易感細胞受體中起重要作用。HBsAg存在于患者血清小球型顆粒、管型顆粒和Dane顆粒中，HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中會出現(xiàn)HBsAg，其定性檢測是判斷乙型肝炎病毒感染狀態(tài)的常規(guī)指示，對乙型肝炎臨床早期診斷抗病毒治療方案的選擇及預后判斷均具有重要意義；另外，HBsAg也是乙肝疫苗重要的免疫原之一。

早期HBsAg主要是從乙型肝炎病毒感染者血液中獲得，該種血液存在著不良因素，可能混有其他病原體或其他型的肝炎病毒。近年來隨著乙肝治療水平的提高和計劃免疫的推行，高效價血源HBsAg的獲取越來越困難。因此，借助分子生物學和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，目前國際上應用的免疫學檢測技術(shù)和疫苗主要是酵母或CHO細胞表達的S蛋白，但大約有5%-10%的人群存在免疫逃避。盡管近年來許多科研工作者投身乙肝表面抗原的研究，中國預防獸醫(yī)學院病毒研究所也成功研制CHO細胞中表達的含S和PreS1基因的乙肝表面抗原，但是細胞株的表達量低，導致產(chǎn)量低，成本居高不下，遠遠不能滿足市場的需求。

HBsAg主要由S、前S1和前S2三個亞基組成。其中S由226個氨基酸組成，是乙肝預防性疫苗的組成成分。但含有前S1抗原的第3代預防性疫苗Hepacare,其抗體陽轉(zhuǎn)率可以達到95%左右，免疫原性明顯優(yōu)于單純的S蛋白。研究顯示，前S1抗原的21-28位氨基酸是一個T細胞識別位點，第12-32和32-53位氨基酸是B細胞決定簇，第21-47位氨基酸是HBV結(jié)合肝細胞的主要區(qū)域，針對它的抗體可以封閉該位點并阻止HBV的再感染。因此我們將表達前S1的肝細胞結(jié)合位點aa21-47編碼基因串聯(lián)到HBsAg編碼基因的碳端,使其與S蛋白以嵌合蛋白的形式在大腸桿菌中大量表達，以期可以得到成本低、特異性好、靈敏度高的乙肝表面抗原，為免疫學檢測技術(shù)和高效廉價疫苗的開發(fā)提供生物原材料，有效降低檢測成本和疫苗生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于制備特異性強、靈敏度高的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的氨基酸組成如SEQ?ID?NO.9所示；或所述乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白氨基酸組成與SEQ?ID?NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種操作簡單成本低的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的制備方法。

為達到以上目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

a.重組質(zhì)粒pET-28a-S的構(gòu)建：將堿基組成如SEQ?ID?NO.2的序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切后，克隆入經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-S；

b.重組質(zhì)粒pET-28a-S-S1的構(gòu)建：將堿基組成如SEQ?ID?NO.6的序列采用限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI雙酶切后，克隆入經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pET-28a-S中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-S-S1；