[發明專利]一種生物活性多肽QEPV及其制備和應用

有效

• 申請號: 201210536588.3
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103012552A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 張少輝;盧姍姍;馬鎏镠;孫冠華;崔磊;金贏凱;徐海紅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K5/103
• 分類號: C07K5/103;C07K1/20;C12N15/11;C12P21/02;C12P21/06;A23L1/29;A61K38/07;A61P39/06;A61P37/04;C12R1/225
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及蛋白領域，具體涉及一種生物活性多肽QEPV及其制備和應用。

背景技術

在牛乳經乳酸菌發酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質被乳酸菌代謝利用，并發生了一系列生理生化反應，使蛋白質變為多肽或者游離的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉運直接進入人體的血液循環。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性肽”。

免疫活性肽是繼阿片肽發現后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性肽。1981年，Jolles等人首次發現，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個氨基酸序列為Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，體外實驗證明該肽能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊血紅細胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人發現來自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能夠刺激綿羊血紅細胞對小鼠腹膜巨噬細胞的吞噬作用以及增強對于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調節肽（PGPIPN）飼喂大鼠發現大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬作用和紅細胞相關的免疫調節功能有顯著的增強。

研究表明，免疫活性肽不僅能夠增強機體免疫力，刺激機體淋巴細胞的增殖，增強巨噬細胞的吞噬功能，促進細胞因子的釋放、提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應。

免疫活性肽無論是作為功能食品還是藥品，其最終都要攝入人體內被人體吸收，只有到達相應的靶器官才能發揮其生理功能。在人體胃腸道復雜的環境下，肽極容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等一系列酶的影響而發生降解，從而在體內失去生理活性，無法達到預期目的。因此，研究免疫調節肽的抗胃腸道酶降解的能力對于其今后的應用具有重要意義。其次，有些生物活性多肽是在動物的胃腸道里經過各種生物酶降解后生成的新片段，被動物吸收后發揮其生活活性作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln-Glu-Pro-Val（QEPV）（SEQ?ID?NO：1）。

較優的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。

本發明的生物活性多肽QEPV為乳源性，具體來源于β-酪蛋白，并且為β-酪蛋白（SEQ?IDNO:3）第209~212位的氨基酸殘基。

較優的，所述生物活性多肽具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。

本發明的生物活性多肽可以通過基因工程的方法和化學方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。

本發明還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段。

β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術，編碼β-酪蛋白第209~212位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽QEPV。

進一步的，編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列為：5’-caggagcctgta-3’(SEQ?IDNO:2)。

本發明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下：

1）發酵：將瑞士乳桿菌（Lactobacillus?helveticus）添加到脫脂乳中進行厭氧發酵，獲得瑞士乳桿菌發酵乳；

2）多肽的粗提：對步驟1）的瑞士乳桿菌發酵乳進行低溫離心分離，取上清液；

3）多肽的純化：

a.對步驟2）的上清液進行超濾處理，收集濾液；

b.收集的濾液采用反向層析柱SOURSE?5?RPC?ST（4.6×150mm）進行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽QEPVL；

4）多肽的消化：采用兩步酶解法酶解步驟3）的生物活性多肽QEPVL，獲得生物活性多肽QEPV；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。

本發明所述脫脂乳為經過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0.1%。

較優的，所述厭氧發酵的條件為：發酵溫度36～38℃，發酵培養15～20h；優選發酵培養19h。

較優的，步驟2）所述低溫離心的條件為：4℃，8000～10000rpm，離心15～30min。

較優的，步驟3）a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為10kDa和3kDa。本發明采用截留分子量分別為10kDa、3kDa的濾膜，使樣品依次通過兩張濾膜進行超濾。

更優的，步驟3）a所述超濾過程中，壓力范圍為0.1~0.3MPa，濾液流速為0.8～1.2mL/min。