[發明專利]冬蟲夏草中國被毛孢二氫乳清酸氧化酶、編碼基因及應用

無效

• 申請號: 201210535846.6
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN103045550A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 鄭裕國;柳志強;吳暉;李邦良;吳玲芳;許靜;許峰;薛亞平;袁水金;王鴻艷
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P17/12;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術領域

本發明涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與二氫乳清酸出發合成代謝乳清酸的二氫乳清酸氧化酶（dihydroorotate?oxidase），編碼這個酶的基因及其應用。

（二）背景技術

冬蟲夏草（Cordyceps?sinensis?(Berk.)?Sacc.）是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus?armoricanus?Oberthur）幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢子階段（有性型）。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態環境，故其產量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發酵上。利用液體深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體、提取物或發酵液,是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發酵生產蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業化大規模生產。生產出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力于蟲草菌絲體的發酵培養。人工發酵培養冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發酵條件的優化，菌絲體生物量和代謝產物的量均有明顯提高。

近年來，隨著天然產物化學和現代色譜技術的飛速發展，在對蟲草產品研發中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產物研究。國內外已對蟲草代謝產物做了大量的研究，代謝產物主要包括核苷、多糖、多肽、甾醇等幾大類化合物，其中嘧啶類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。

核苷類是蟲草最主要的活性物質之一，其中嘧啶類核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿嘧啶核苷(uracil?riboside)又稱尿苷(uIidine)，別稱由雪核糖苷、二氫嘧啶核苷、1-β-D-喃核糖基尿嘧啶。胞嘧啶核苷(cytosine?riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、1-β-D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應用于中樞神經、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國，核酸類藥品近年來在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。

乳清酸，也稱維生素B13，在60年代，用于治療黃膽和一般肝臟機能障礙。近年雖被新藥代替，但它具有改善肝功能，促進肝細胞的修復作用和其它新功能。如：可治療痛風病，改進腦血管循環，增加吞噬細胞活性，提高組織再生能力，有助于治愈傷口。還可用于免疫輔藥。可以治療慢性X線中毒，作為化學品中毒的預防劑和治療劑。

二氫乳清酸的氧化是由二氫乳清酸還原酶(dihydroorotate?dehyolrogenase)催化，二氫乳清酸氧化生成乳清酸(orotate)。此酶需FMN和非血紅素Fe₂^＋，位于線粒體內膜的外側面，由醌類提供氧化能力，此酶存在于胞液中。

目前，作為重要合成代謝嘧啶類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘧啶類核苷合成代謝途徑中相關基因和蛋白的研究還很少見。

（三）發明內容