[發明專利]高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株

無效

• 申請號: 201210534876.5
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102965342A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 余瓊
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基因工程細胞株。

背景技術

肥胖是長期以來困擾人類健康的主要問題之一，特別是隨著社會經濟的發展，人們生活水平的不斷提高，肥胖患者越來越多，而且肥胖會引發高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風癥及關節炎，是很多疾病的誘因之一。因此合理控制體重是很多肥胖者的夢想。

減肥屬于以減少人體過度的脂肪、體重為目的的行為方式。指運用藥物、飲食、運動、中醫經絡，心理療法來達到減少身體脂肪堆積的一種現象，設法糾正肥胖者異常反應造成的不當行為，即用行為科學分析肥胖者攝食行為的特征和運動類型，以此為基礎，合理修正導致肥胖的行動。

通過飲食和運動減肥都需要漫長的時間，而且需要毅力堅持，很多人都半途而廢，導致體重反彈。中醫經絡減肥給人以恐懼感，很多人望而卻步。藥物減肥是目前減肥主要形式，被很多人采用。但是化學藥劑都存在一定的毒副作用，損傷身體，因此人們比較推崇天然減肥制劑。但由于天然減肥物質種類少，而且含量低，生產周期長，很難滿足市場的需求。

發明內容

本發明要解決現有天然減肥物質種類少，含量低，生產周期長，很難滿足市場的需求的問題，而提供的一株高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。

本發明高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株按以下步驟制備：

一、設計瘦素轉基因序列，基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；?

二、合成瘦素轉基因DNA片段Obese’，再導入T載體中；

三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoRⅠ雙酶切消化T載體，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到插入片段Obese’；

四、質粒載體雙酶切：用BamHI和EcoRⅠ雙酶切消化質粒載體pcDNA3.1/V5-His-C，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用0.6%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到酶切后的載體pcDNA3.1/V5-His-C；

五、插入片段Obese’與經過雙酶切的載體pcDNA3.1/V5-His-C連接，連接反應體系為

連接反應條件為16℃放置過夜，獲得連接產物重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’；?

六、重組質粒轉染CHO：將構建好的重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’與質粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM?2000?Reagent共轉染CHO-dhfr^-細胞，在24孔板中進行轉染，細胞達到95%融合時，將培養基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，轉染6h后更換含100mL/L?FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，繼續培養48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉染的細胞按1:10傳代，24h細胞貼壁后更換為不含HT和NAA、含G418??0.75mg/L和FBS?100mL/L的選擇性培養基，培養14～16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉入24孔板，又傳代至12孔板，經?ELISA試劑盒測定對陽性高表達的細胞克隆進行擴大培養；

七、MTX的加壓培養：以MTX加壓篩選，濃度依次為2×10^-8?mmol/L、1×10^-7?mmol/L和5×10^-7?mmol/L，最終得到能夠在5×10^-7?mmol/L的MTX中正常生長的CHO細胞株，即為高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。

Leptin是obese基因編碼的表達產物，由白色脂肪細胞和胎盤產生的由167個氨基酸組成的分泌蛋白，此蛋白可作為影響能量平衡的傳入信號，其功能主要是通過影響能量攝取和支出實現減低體重的作用。本實施方式對obese基因進行了重新的設計獲得Obese’基因。Obese’基因由114個堿基組成，編碼38個氨基酸的rhLeptin（Recombinant?Human?Leptin，人重組瘦素）。