[發明專利]高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株

無效

• 申請號: 201210534876.5
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102965342A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 余瓊
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，其特征在于高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株按以下步驟制備：

一、設計瘦素轉基因序列，基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；?

二、合成瘦素轉基因DNA片段Obese’，再導入T載體中；

三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoRⅠ雙酶切消化T載體，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到插入片段Obese’；

四、質粒載體雙酶切：用BamHI和EcoRⅠ雙酶切消化質粒載體pcDNA3.1/V5-His-C，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用0.6%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到酶切后的載體pcDNA3.1/V5-His-C；

五、插入片段Obese’與經過雙酶切的載體pcDNA3.1/V5-His-C連接，連接反應體系為

連接反應條件為16℃放置過夜，獲得連接產物重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’；?

六、重組質粒轉染CHO：將構建好的重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’與質粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM?2000?Reagent共轉染CHO-dhfr^-細胞，在24孔板中進行轉染，細胞達到95%融合時，將培養基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，轉染6h后更換含100mL/L?FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，繼續培養48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉染的細胞按1:10傳代，24h細胞貼壁后更換為不含HT和NAA、含G418??0.75mg/L和FBS?100mL/L的選擇性培養基，培養14～16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉入24孔板，又傳代至12孔板，經?ELISA試劑盒測定對陽性高表達的細胞克隆進行擴大培養；

七、MTX的加壓培養：以MTX加壓篩選，濃度依次為2×10^-8?mmol/L、1×10^-7?mmol/L和5×10^-7?mmol/L，最終得到能夠在5×10^-7?mmol/L的MTX中正常生長的CHO細胞株，即為高效分泌表達瘦素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。