[發(fā)明專利]msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210533952.0
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102965325A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。

背景技術(shù)

老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查（NHANES?Ⅲ，1988~1994年）結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險(xiǎn)明顯加大。中國老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬，占總?cè)丝诘?.1%。隨著社會老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預(yù)計(jì)到2050?年將增加到2.21億，那時(shí)全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國。有學(xué)者對1995~1996年美國骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進(jìn)行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。

當(dāng)骨折發(fā)生時(shí)，患者最初的感受便是疼痛。在骨折早期治療過程中，疼痛從始至終都存在著。它不僅影響患者的治療效果，同時(shí)也直接影響肢體的功能恢復(fù)。不同類型的骨折均存在不同程度的疼痛、功能障礙、肢體腫脹，而疼痛是首先應(yīng)考慮解決的問題。因?yàn)樘弁纯梢鸾桓猩窠?jīng)興奮，繼而反射性抑制胃腸功能，引起食欲減退；疼痛還可影響睡眠質(zhì)量，引起體內(nèi)多種激素的釋放，產(chǎn)生相應(yīng)的病理生理改變，使機(jī)體抵抗力下降,直接影響創(chuàng)傷愈合及功能恢復(fù)。因此解除骨折患者的疼痛感是治療的重要組成部分。

如果患者服用多種藥物治療骨質(zhì)疏松并止痛，容易產(chǎn)生藥物拮抗反應(yīng)；若要錯開服藥時(shí)間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。

目前缺乏一種可以同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和止痛的藥品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決目前尚無同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和止痛藥品的缺陷，而提供的一種msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。

msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx），大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步驟制備：

一、將含有msCT-CTx融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC（msCT/CTx）用BamH?I和EcoRⅠ雙酶切，獲得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段；

二、用BamHI和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pGEX-6P-1；

三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX-6P-1進(jìn)行酶連接，然后16℃放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/CTx；

四、用載體pGEX-msCT/CTx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），選擇陽性重組子，即獲得msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）。

本發(fā)明中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

由于骨折患者均為突然致傷，無思想準(zhǔn)備，再加上相關(guān)知識缺乏，治療過程長；患者因疼痛恐懼常呈被動體位，特別是老年骨折患者，往往會引起將來功能障礙，而且恢復(fù)期較長。本發(fā)明msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）發(fā)酵產(chǎn)生的msCT-CTx融合蛋白可治療骨質(zhì)疏松的同時(shí)止痛，對于骨質(zhì)疏松所引發(fā)骨折的患者治療效果顯著，而且由于可以明顯減輕或消除患處疼痛感，患者心理負(fù)擔(dān)小、康復(fù)快，愈后功能恢復(fù)期短。

本發(fā)明用于治療骨質(zhì)疏松和止痛的msCT-CTx融合蛋白微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。

本發(fā)明msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）發(fā)酵產(chǎn)生的msCT-CTx融合蛋白共60個氨基酸。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)msCT-CTx融合蛋白，具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明為治療骨質(zhì)疏松和止痛奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式msCT-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx），大腸桿菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步驟制備：