[發明專利]壬基酚人工抗原的制備方法

有效

• 申請號: 201210533788.3
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103012582A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 甘金華
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，更具體涉及一種壬基酚人工抗原的合成方法,本發明利用琥珀酸酐法，將壬基酚上面的羥基進行衍生化，以引進能夠與蛋白反應的功能團。利用改進的碳二亞胺法將衍生物NP-HS與蛋白載體反應，合成相應的人工抗原，為壬基酚抗體制備提供技術支持。

背景技術

壬基酚（Nonylophenol，NP），是一種重要的精細化工原料和中間體，主要用于生產表面活性劑、也用于抗氧化劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農藥乳化劑等領域，由于NP高度疏水性及化學性質穩定，因此容易在環境中富集而廣泛分布，同時通過食物鏈對水生生物、動物及人類造成危害。有專家表明，NP具有雌激素效應，可導致動物生殖系統的損害，同時對雄性動物的生殖功能也有影響，并對其血清中睪丸酮水平和某些生化指標產生影響。

為了確保人類安全與健康，建立快速、準確監測壬基酚等有害物質的殘留是十分必要的。傳統的殘留分析方法包括氣相色譜法、液相色譜法、質譜、薄層層析等，這些方法往往需要很復雜昂貴的儀器，而且需要經過繁瑣的前處理，很難達到快速、簡便的現場檢測要求。而免疫檢測分析方法由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優點，近年來備受人們的關注。因此，建立起NP的免疫快速檢測方法，對于實踐中批量化測定樣品中NP殘留意義重大。本試驗制備成功的人工抗原以及由此制備的高效價抗體，可為建立快速檢測NP殘留的免疫試劑盒提供可靠保證。

壬基酚是小分子化合物，本身不具備免疫原性，不能直接刺激機體產生抗體，必須與連接到大分子載體上以形成較為理想的免疫原。在本實驗中，用改進的碳二亞胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA,并對其進行鑒定。然后以此人工抗原免疫balb/c小鼠，制備單克隆抗體，對NP的ELISA檢測方法進行研究。為下一步研制壬基酚殘留檢測試劑盒建立很好的技術平臺。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種壬基酚人工抗原的制備方法，該方法合成步驟簡單易操作，副反應少，目標物純度高。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種壬基酚人工抗原的制備方法，其步驟是：

(1)按摩爾比1:1.3稱取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反應瓶中，加入DMSO作為溶劑，90℃反應1h后冷卻至室溫(20-25℃,以下相同)。將冷卻的反應液緩慢的加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液瞬間變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質進行抽濾沉淀，用冰超純水洗滌后抽干，50℃烘干后重結晶3次，干燥得到的淡黃色油狀物即為NP-HS。

(2)按摩爾比30：30：1稱取N-羥基琥珀酰亞胺：水溶性碳二亞胺：牛血清白蛋白共溶于0.01mol/1PBS中，4℃下攪拌反應過夜。將上述溶液離心（5000r/min，10min），所得上清液為A液；按摩爾比30:6.5的比例稱取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液槍取1/2體積的上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應3-5h。將反應后的溶液離心（5000r/min，10min），上清液為B，取上清液B，以PBS（pH=7.4）溶液做透析液，置4℃透析3天，每7-9h換一次透析液，除去未反應的DMF、CDC、NHS、NP等小分子物質。將透析好的反應液用棕色玻璃小瓶分裝后置于-40℃冰箱中冷凍過夜，然后轉移到冷凍干燥機中進行干燥，獲得一種壬基酚人工抗原,于-20℃冰箱保存。

人工抗原的鑒定：先根據SDS-PAGE結果測定BSA及NP-BSA的分子量，再采用紫外掃描儀測定得到的壬基酚－牛血清白蛋白的偶聯比，分別在279ｎｍ、278ｎｍ波長處測定吸光度值，并計算偶聯比。

本發明與現有技術相比,具有以下優點和效果:

壬基酚的物理化學性質決定了在人工抗原的合成過程中可利用的活性基團僅有羥基，對此我們設計了對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、碳二亞胺法、活潑酯法、琥珀酸酐法五種不同的人工抗原合成方法和技術方案，經紫外掃描圖分析對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、活潑酯法都沒有合成目標物，僅碳二亞胺法和琥珀酸酐法合成了目標物，但是碳二亞胺法合成的目標物太少、得率較低。最后經比較分析后確定琥珀酸酐法最優，該方法合成步驟簡單易操作，副反應少，目標物得率高、純度高，所獲得的抗血清效價高。

附圖說明

圖1為一種SDS-PAGE實驗結果示意圖。

電泳結果顯示新合成的NP-BSA與BSA相比其相對遷移率發生了改變。

圖2為一種BSA(1g/L)紫外掃描示意圖。