[發(fā)明專利]中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白化學發(fā)光檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210533781.1
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN102967714A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設計）人: 曹青;潘學繼;王立凱;單存海;洪宇霞
• 申請（專利權）人: 天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發(fā)明屬于免疫分析醫(yī)學技術領域，具體地涉及一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白化學發(fā)光檢測試劑盒及制備方法。

背景技術

中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil?gelatinase?associated?lipocalin，NGAL)，又稱人脂質(zhì)運載蛋白2(lipocalin2，Ln2)或噬鐵蛋白(siderocalin)，是人脂質(zhì)運載蛋白家族中的成員。在生理狀態(tài)下，中性粒細胞、腎小管上皮細胞、肺泡巨噬細胞、支氣管上皮黏液細胞等分泌少量NGAL，而腦和周圍神經(jīng)、結腸、子宮和卵巢、胎盤、甲狀腺等組織細胞中NGAL的表達呈陰性。健康志愿者NGAL的濃度范圍大約為，尿液：0.7～9.6ng/mL；血漿：34～106ng/mL。根據(jù)急性腎損傷（AKI）患者90%陽性預測值判斷，尿液中NGAL的陽性判斷值為350ng/ml，血漿檢測的陽性判斷值為400ng/ml。當發(fā)生急性腎損傷時，血、尿NGAL濃度通常會迅速升高，2h最為明顯，尿液中NGAL濃度可以達到110ng/ml到40000ng/ml，血液中NGAL濃度可以達到25ng/ml到3500ng/ml，這使之成為早期且敏感的腎損傷生物標志物。

急性腎損傷是比較嚴重的病癥，可由多種因素引起，如心臟手術或腎移植手術，糖尿病以及敗血病等。臨床上，由于腎臟對缺血性損傷和腎毒性等方面的響應，以及AKI早期生物標記的缺乏而延誤開始治療的時機，導致發(fā)病后的死亡率大大增加。傳統(tǒng)的診斷方法包括測定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率等。但這些方法只能在損傷后一天甚至幾天內(nèi)檢測出。而此時，腎功能已退化。其中，血清肌酸酐的變化被廣泛用來檢測AKI，但現(xiàn)已明確，當血清肌酸酐變化時，50%的腎功能已經(jīng)喪失。因此，對腎損傷的可靠的早期生物標記的鑒定，對于早期的疾病治療是非常必要的。NGAL檢測試劑盒的應用，可以使醫(yī)生在損傷幾小時內(nèi)做出診斷結果并進行及時治療。因此，對NGAL的檢測對于腎損傷的臨床診斷具有十分重要的意義。

NGAL的檢測最初采用western?blotting法。2005年丹麥BioPorto公司首先推出ELISA商品試劑盒，可用于血清(漿)、尿液的NGAL檢測。另外，美國R＆D?Systems公司也研發(fā)出ELSIA試劑盒。美國博適公司研發(fā)的試劑盒采用雙抗體夾心免疫熒光層析法，但其檢測限要遜于ELISA方法，而ELISA方法受影響因素也較多，準確性較差。

我國的武漢生之源生物科技有限公司提供的檢測方法是使用免疫比濁法，其檢測結果受血脂濃度影響較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種靈敏度高，檢測時間短，特異性好，穩(wěn)定可靠的中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白化學發(fā)光檢測試劑盒。

本發(fā)明的技術方案概述如下：

一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白化學發(fā)光檢測試劑盒，包括以下組份：

①中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白標準品，所述中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白簡稱NGAL；

②辣根過氧化物酶標記的NGAL單克隆抗體；

③包被有NGAL單克隆抗體的磁顆粒；

④白色不透明微孔板；

⑤洗滌液；

⑥化學發(fā)光底物A和B；

其中，所述包被有NGAL單克隆抗體的磁顆粒經(jīng)過以下步驟制備:

①取5.0ml磁顆粒質(zhì)量含量為2.5%的磁顆粒懸浮液，磁板分離棄上清，用去離子水洗磁顆粒；所述磁顆粒懸浮液中的液體是濃度為0.05mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液；

②用0.05mol/L?pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液洗磁顆粒；

③將0.05mol/L?pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液與步驟②獲得的磁顆粒混合使總體積為5.0～10.0ml；

④加入5.0mgNGAL單抗，于搖床上勻化5～10分鐘；

⑤加入5.0～10.0mg碳二亞胺，于搖床上勻化5～10小時；

⑥用0.1mol/LpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌2次；

⑦加入Tris-EDTA緩沖液，調(diào)整總體積至5.0ml，調(diào)pH為7.5，2～4℃保存；

所述辣根過氧化物酶標記的NGAL單克隆抗體是用下述方法制備：

①取1.0mg?NGAL單克隆抗體，加入0.5～1.0ml濃度為0.05mol/L，pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液溶解，2～4℃保存；