[發明專利]一管式檢測突變位點的不同突變類型

無效

• 申請號: 201210532462.9
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103865982A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 曲海濤;王德國;張文超
• 申請（專利權）人: 哈爾濱德歌生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一管式共用引物法檢測不同突變位點不同突變類型（也包括同一突變位點的不同突變類型），此發明可以應用于等溫擴增檢測技術領域，也可以應用于PCR檢測等領域，檢測結核桿菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒等基因突變或耐藥檢測。?

背景技術

目前在行業應用最廣范的耐藥檢測是藥敏實驗和基因芯片技術，藥敏實驗耗時太長，基因芯片雖然能實現高通量檢測但是制備成本及檢測費用均較昂貴，靈敏度低，不宜大面積推廣。因此急需一種檢測成本低、靈敏度高切實可行的方法。?

發明內容

本發明的目的是：提供一種同時一管式檢測不同突變位點不同突變類型（也包括同一突變位點的不同突變類型）的核酸擴增檢測方法。?

本發明的技術方案是：依據我們公司的德歌等溫擴增核心反應結構（見附圖1），引物F₀為變值，兩個F₀可以是同值也可以是不同值，但不能產生二聚體的任何引物片段（當然也可以是0值，即沒有F₀），為提高反應效率F₀可以設為目標DNA擴增區段內片段。?

1、一管式共用引物法檢測同一突變位點的不同突變類型：?

突變點可以設計到引物B或A上，如果設計到引物B上，為提高反應效率只能在A_C區兩端加入其它引物（見附圖2），當然為了加快反應可以加入更多的引物，前提是不能引起二聚體，而不能在DNA的B_C區再加入其它引物結構，要保證引物B是反應的必要引物片段（也就是沒有引物B，擴增反應不可能發生）。為了加快反應F0可以取反應區段的DNA片段，如A片斷。當然也可以個別取A值，個別取0值。

如果DNA片斷B兩側仍有其它突變位點，而且相距很近，無法保證引物B的特異性，就如同我們權利要求5中的情況，要保證引物A及為加快反應另外加入的引物的特異性，通過聯合保證特異性的方法保證特異性。也就是引物B的對向引物特異性保證了，此結構只能和目標DNA擴增，前提是引物B不能和反應區段內的其它DNA位點吻合，而和目標DNA以外的DNA片段吻合卻不會引發擴增反應。以上就是我們檢測同一突變位點的不同突變類型及聯合保證特異性的核心理念。?

具體的引物設計可以參考我們的另一個專利（申請號：201210474669.5）：一管式共用引物法檢測同一突變位點的不同突變類型，此處共用引物就是非覆蓋突變位點的引物。?

2、一管式檢測不同突變點位點的不同突變類型：?

我們假定同時檢測結核分枝桿菌516、526、531三個突變位點，突變類型如下：D516V(A→T)、D516G(A→C)、H526Y(C→T)、H526D(C→G)、S531L(C→T)、S531W(C→G)，這幾種突變都會導致利福平耐藥，我們無須確定基因突變是以上哪種類型，只要檢測出以上一種突變存在即可檢測出利福平耐藥，那么引物結構設計(見附圖3)，其中B1為覆蓋531突變位點引物，?B2為覆蓋526突變位點引物，?B3為覆蓋516突變位點引物，如圖的引物結構，如果516、526、531均未突變，這個結構就不會發生擴增反應，如果有一點突變和設計引物吻合，就會發生擴增反應，就可以判斷有基因突變，利福平耐藥，這樣一管就可以實現是否有基因突變的檢測，當然為了加速反應，還可以在3’?-5’?AC側加入對應引物（見附圖4），以加快解鏈和合成鏈的作用，原理同上，應不能在覆蓋突變位點側加入其它引物，以保證此側為必要反應條件。

本發明以我們公司發明的德歌等溫擴增系列新方法（專利申請號：201210474669.5）為基礎，單獨針對一個突變點而言，主要目的是保證覆蓋突變點引物為必要反應條件為原理，從而實現了一管式同時檢測不同突變位點的不同突變類型，所有的引物結構仍依托于德歌等溫擴增的核心反應結構，只是在核心反應結構上的變通，專業人士應該明白，任何其它的變通形式均在我們核心結構的保護范圍。?

3、引物設計實例?

將覆蓋突變點的引物和對向引物中的F0均設計成引物A為保證C和G的含量并在5’端加入了兩個T

D516V(A→T)引物：TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGT

D516G(A→C)引物：TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGC

H526Y(C→T)引物：TTCACGCTCACGTGACAGACTGTCGGGGTTGACCT