[發(fā)明專利]以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210530224.4
• 申請日: 2012-12-11
• 公開（公告）號: CN103858757A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖玲;葉紹云;蔡南海;許駿
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益(上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，特別涉及一種以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

甜葉菊(Stevia?rebaudiana?Bertoni)又名“甜菊”、“甜草”，原產(chǎn)于南美巴拉圭，幾個世紀以來一直被當?shù)鼐用褡鳛樘鹞讹嬃巷嬘茫且环N小型多年生菊科(Compositae)斯臺維亞屬植物，宿根性、須根型、多年生、短日照、草本植物。1970年日本從巴西引進甜葉菊，開始馴化、栽培、制備出糖苷，同時進行毒理、食品檢測等試驗，并首先開發(fā)利用甜葉菊產(chǎn)品—甜葉菊糖苷；我國于1976年開始由南京中山植物園、中國農(nóng)業(yè)科學院等科研單位先后從日本引進甜葉菊試種成功。現(xiàn)在江蘇、福建、山東、新疆、河南、安徽等地都有大量種植，總面積達100萬畝以上，我國已成為世界上種植甜葉菊面積最多的國家，也是世界上甜葉菊糖苷最大的生產(chǎn)國和出口國。

甜菊糖苷（甜菊糖）是從甜葉菊的甜葉中提取的一類高甜度、低熱量、對人體無副作用的天然產(chǎn)物，對肥胖病、糖尿病、高血壓病、心臟病、齲齒等也有一定的輔助治療作用。甜菊糖苷的甜度是蔗糖的300倍，而其熱值卻為蔗糖的1/300，所以目前不少廠家把甜菊糖苷作為一種甜味劑替代蔗糖。甜菊糖苷是理想的甜味食品，人體無法分解甜菊配糖體使它轉(zhuǎn)變成葡萄糖，也不會因此被血管吸收，經(jīng)消化后以纖維形態(tài)會排泄出體外，故不含剩下多余卡路里而引致肥胖或增加糖尿病患者的葡萄糖水平，甜葉菊深受肥胖癥患者和糖尿病人的青睞。甜菊糖苷是最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑，它是繼甘蔗甜菜糖之外第三種有開發(fā)價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三蔗糖”。甜菊糖苷代替部分蔗糖加工食品飲料可大大降低用糖成本。隨著人們對健康的關(guān)注程度越來越重，甜菊糖作為一種功能性糖類必將具有良好的市場前景。我國衛(wèi)生部于1985年和1990年分別批準了甜葉菊糖苷為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料，美國FDA于2008年12月對甜菊糖苷可用作甜味劑正式審批，2011年11月14日歐盟也已經(jīng)批準甜菊糖苷作為一種甜味劑在歐盟使用。甜葉菊逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點，這將帶動甜葉菊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

甜葉菊為自交不親和異花授粉植物，遺傳穩(wěn)定性差，不利于雜交種的純合及品種的防雜保純，而且，甜葉菊種子細小，發(fā)芽率低，僅靠種子繁殖無法滿足市場上對甜葉菊的需求。采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能保持品種的優(yōu)良特性，還可以不受外界條件的影響常年繁殖。20世紀70年代開始，國內(nèi)不少研究單位就進行了甜葉菊組織培養(yǎng)的研究。但大多都是以快繁為目的的實驗，利用帶有芽點的莖尖、側(cè)芽等，其擴繁系數(shù)有限，增殖系數(shù)低。利用不帶芽點的葉片等外植體，一般報道僅為20-60%，再生增殖系數(shù)3-10。沈秀麗等（1996）以葉片為外植體在添加BA?0.5mg/L和NAA0.5mg/LMS的培養(yǎng)基上，不定芽再生率為20%，再生增殖系數(shù)為3；倪德祥等（1985）采用甜葉菊葉片為外植體，在MS添加BA?2.0mg/L和NAA?2.0mg/L培養(yǎng)基上不定芽再生率為37%，再生增殖系數(shù)為9.3/10塊；Jain等（2009）在添加BAP?2.2uM和IAA?2.8uM的MS培養(yǎng)基上，甜葉菊葉片外植體的不定芽再生率為45%，再生增殖系數(shù)9.2。一般甜葉菊葉片外植體需經(jīng)過3、4代愈傷組織繼代培養(yǎng)才能再生，再生時間長，再生增殖系數(shù)低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供再生率高和/或再生增殖系數(shù)高的以葉片為外植體的三種甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。

本發(fā)明所提供的以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法一，包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導與分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟；所述愈傷組織誘導與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基；所述植物生長物質(zhì)含有NAA和TDZ。

上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一中，所述植物生長物質(zhì)還可含有其它的植物激素或植物生長調(diào)節(jié)劑，如6-BA、KT、IBA、2,4-D、IAA。

上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一中，所述愈傷組織誘導與分化培養(yǎng)基中，NAA的濃度可為0.1mg/L-0.2mg/L，如0.1mg/L、0.15mg/L、0.2mg/L、0.1-0.15mg/L、0.15-0.2mg/L，TDZ的濃度可為1.0mg/L-3.0mg/L，如1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、1.0-1.5mg/L、1.5-2.0mg/L、2.0-2.5mg/L、2.5-3.0mg/L。