[發(fā)明專利]一種最適溫度提高的脂肪酶突變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210527837.2
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN102994471A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喻曉蔚;徐巖;吳厚軍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/10;C12N1/19;C12N5/10;C12N15/81;C12P7/64;A21D8/04;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脂肪酶突變體，特別是一種最適溫度提高的脂肪酶突變體及其應用。

背景技術(shù)

脂肪酶（EC?3.1.1.3）不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、酸解等反應，被廣泛地應用于化學，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是工業(yè)脂肪酶的一個重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過30種根霉脂肪酶實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。根霉脂肪酶常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在較高溫度下進行，而根霉脂肪酶屬于中溫脂肪酶，最適溫度為40°C，限制了其應用范圍，降低了催化效率。

蛋白質(zhì)理性設(shè)計是改變酶性質(zhì)的有利工具，它建立在人們對酶結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系和催化機理的了解上，對選定的位點進行突變，從而優(yōu)化酶分子的各種性質(zhì)。進年來，隨著結(jié)構(gòu)生物學、分子動力學模擬、蛋白質(zhì)折疊機制等領(lǐng)域的發(fā)展，酶的理性設(shè)計已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反應活性，改進底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對映立體選擇性等方面（Bornscheuer?U?T?et?al.Trends?Biotechnol,2002,20(10):433-437。

發(fā)明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉（Rhizopus?chinensis）CCTCC?M?201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并實現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）中的高水平分泌表達（Yu?Xiao-Wei?et?al.J?Mol?Catal?B:Enzym,2009,57:304-311），應用研究表明該酶在烘焙食品工業(yè)、皮革脫脂以及造紙廢水處理中都具有非常廣闊的應用前景。本發(fā)明以華根霉脂肪酶基因為模板，利用蛋白質(zhì)理性設(shè)計技術(shù)獲得了最適溫度提高的脂肪酶突變體，提高了該酶的應用范圍與催化效率。

酶的最適溫度可以通過將酶在相同的標準條件下測定催化活力來測定，酶催化活力最高時的反應溫度即為該酶的最適溫度。

定義：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

脂肪酶突變體的標識

采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸。Asp310Val，表示位置310的氨基酸由親本脂肪酶的Asp替換成Val。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種最適溫度提高的脂肪酶突變體，在GenBankXXXXX公布的脂肪酶脂肪酶基因序列第310的氨基酸由親本脂肪酶的Asp突變?yōu)閂al。

上述突變體的獲得方法為以GenBank?EF405962公布的脂肪酶脂肪酶基因序列為出發(fā)基因,將其第310位的氨基酸由Asp替換成Val。

產(chǎn)所述脂肪酶突變體的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系也為本發(fā)明要求的保護范圍。

所述產(chǎn)脂肪酶突變體的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：

1）采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶突變體基因；

2）將步驟1）獲得的脂肪酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；

3）將步驟2）獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到基因工程菌。

所述表達載體為pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα或pPICZ。

本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)上述脂肪酶突變體的方法，以產(chǎn)脂肪酶突變體基因工程菌為生產(chǎn)菌株，按10％（V/V）接種量接入25mL?BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)16～20h至OD₆₀₀為2～6，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀為1，每隔24h添加0.5%的甲醇誘導表達，培養(yǎng)3-4d后，收集發(fā)酵上清液；將發(fā)酵上清液經(jīng)過10KD超濾膜濃縮，SP-Sepharose?FF強陽離子交換層析和Phenyl-Sepharose?6FF疏水色譜柱層析后得到純化的突變脂肪酶活性組分。