[發(fā)明專利]集成基因代謝和重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210527589.1
• 申請(qǐng)日: 2011-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103114048A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳雪昌;王品美;鄭道瓊;陶香林;劉天喆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12R1/865;C12R1/46
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)?01110293244.X、名稱為“低甘油合成、高酒精耐性的工業(yè)釀酒酵母菌株及其應(yīng)用”的發(fā)明專利的分案申請(qǐng)。?

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法。?

（二）背景技術(shù)

酒精濃醪發(fā)酵，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是發(fā)酵過(guò)程中的高濃度發(fā)酵，具體表現(xiàn)在生產(chǎn)有以下特點(diǎn)：1、高酒份；2、高滲透壓；3、高酵母數(shù)。就酒精生產(chǎn)而言，不同原料、不同時(shí)期濃醪發(fā)酵的界限存在著明顯的差別；大概區(qū)分如下：淀粉質(zhì)原料：酒精濃度在14～16%（V/V），糖蜜原料：酒精濃度在10～12%（V/V）。?

實(shí)現(xiàn)酒精濃醪發(fā)酵技術(shù)，可極大地提高設(shè)備利用率、減少工藝用水、降低蒸煮蒸餾能耗和生產(chǎn)成本，對(duì)提高乙醇生產(chǎn)的效率與經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益具有重要現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。與常規(guī)酒精發(fā)酵相比，釀酒酵母在濃醪發(fā)酵過(guò)程中，不僅面臨著更加嚴(yán)峻的環(huán)境脅迫（高滲、高酒精脅迫等），還會(huì)因甘油、乙酸等副產(chǎn)物生成的增多而降低葡萄糖乙醇轉(zhuǎn)化率。因此，為達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和糖醇轉(zhuǎn)化率等技術(shù)指標(biāo)的要求，選育副產(chǎn)物合成低并具有高耐性的工業(yè)釀酒酵母菌株是突破濃醪發(fā)酵技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵所在。?

甘油是釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程中主要的副產(chǎn)物，約消耗4%～?10%的總碳源，如這些碳源用于生成乙醇，全球每年無(wú)需增加成本即可增產(chǎn)乙醇13億升。目前，對(duì)酵母細(xì)胞甘油代謝途徑已研究比較透徹，應(yīng)用基因代謝工程技術(shù)對(duì)甘油合成相關(guān)的基因及途徑進(jìn)行修飾和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)高糖、高濃度乙醇等脅迫因子耐受性下降，生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)而引起發(fā)酵速率降低、發(fā)酵周期延長(zhǎng)及乙醇產(chǎn)量降低等不良現(xiàn)象。針對(duì)一個(gè)或少量基因調(diào)控、機(jī)制已知的性狀，基因代謝工程方法是較容易和直接的可行性理性策略，但對(duì)于涉及多個(gè)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性狀（如發(fā)酵速率、耐受性等發(fā)酵性狀），基因代謝工程技術(shù)很難達(dá)到預(yù)期效果，甚至?xí)鹁觋P(guān)鍵性能的退化衰變。目前，已有研究應(yīng)用基于全基因組水平的盲目育種技術(shù)——全基因組重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高濃度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生產(chǎn)性能如糖醇轉(zhuǎn)化率提高并不顯著，而且隨著醪液可發(fā)酵性碳源的增加，副產(chǎn)物合成也增加，極大限制了乙醇產(chǎn)量的提高。?

綜上所述，應(yīng)用單一的育種手段雖然能夠改良菌株某一方面的性狀，但很難獲得性能全面的優(yōu)良菌株，而且容易導(dǎo)致生產(chǎn)菌株關(guān)鍵性能的退化衰變。要從根本上突破濃醪發(fā)酵技術(shù)瓶頸，獲得性能全面的優(yōu)良釀酒酵母菌株，還是需要結(jié)合不同的工業(yè)微生物育種策略優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)劣互補(bǔ)，集成創(chuàng)新，更有效、快速地進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)菌株的改良。?

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種集成基因代謝工程與全基因組重排技術(shù)改良菌株多種生產(chǎn)性能的方法。?

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：?

一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的?方法，所述方法包括：?

（1）誘導(dǎo)釀酒酵母菌株產(chǎn)孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Y1和交配型α的單倍體菌株Y2作為出發(fā)菌株；?

（2）然后分別敲除菌株Y1和菌株Y2的編碼甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因FPS1，并在FPS1位點(diǎn)整合表達(dá)變鏈球菌（Streptococcus?mutans）的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPN），對(duì)單倍體Y1和Y2分別采用G418^r和Zeo^r抗性標(biāo)記篩選，獲得單倍體基因工程菌株：G418^r抗性菌株YFG1（MATa,fps1Δ::PGKp-gapN）和Zeo^r抗性菌株YFG2（MATα,fps1Δ::PGKp-gapN）；?

（3）分別使用紫外和EMS對(duì)菌株YFG1和菌株YFG2進(jìn)行誘變，獲得四個(gè)突變庫(kù)：YFG1紫外誘變庫(kù)、YFG1EMS誘變庫(kù)、YFG2紫外誘變庫(kù)和YFG2EMS誘變庫(kù)；?

（4）以體積濃度8%的乙醇YPD平板篩選生長(zhǎng)迅速的單菌落進(jìn)行第一輪全基因組重排，用含300μg/mL?G418和50μg/mL?Zeocin的YPD平板篩選重排子，誘導(dǎo)重排子產(chǎn)孢破壁后，用體積濃度12%的乙醇YPD平板篩選生長(zhǎng)迅速的單菌落進(jìn)行第二輪全基因組重排，用含300μg/mLG418和50μg/mL?Zeocin的YPD平板篩選重排子，通過(guò)模擬工業(yè)原料的濃醪發(fā)酵測(cè)試，獲得低副產(chǎn)物合成、高糖醇轉(zhuǎn)化率和高乙醇產(chǎn)量的工業(yè)釀酒酵母工程菌株。?