[發(fā)明專利]一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法及試劑盒

無效

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• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN103048444A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王帥;馬春暉;胡建軍;席琳喬;王連群;陳根元
• 申請（專利權(quán)）人: 塔里木大學(xué)
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

瘋草(locoweed)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalas)有毒植物的統(tǒng)稱，由此而引起的中毒病稱為瘋草中毒(Locosim)或瘋草病(Locodisease)。我國瘋草主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、陜西、青海、新疆、西藏等省區(qū)。分布面積已超過1100萬hm²，約占全國草場總面積的2.8％，占西部草場面積的3.3％，且每年以3.5％的速度蔓延。瘋草已成為我國西南、西北牧區(qū)危害草原畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要毒草。苦馬豆素(Swainsonine，SW)是瘋草的主要毒性成分之一，對瘋草中毒病的發(fā)病機理和防治有重要意義。

新疆是我國五大草原畜牧業(yè)省份之一，天然草地總面積為5596.16×10⁴hm²，其中可利用面積4800.68×10⁴hm²，是已墾農(nóng)地的10.4倍，林地的18倍。然而，由于“超載過牧”等原因，現(xiàn)已引起瘋草等有毒植物的廣泛蔓延，優(yōu)質(zhì)牧草嚴重退化，造成大量放牧家畜中毒，其中阿克蘇地區(qū)每年中毒家畜在5％～10％，嚴重時可達50％，不利于新疆畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

瘋草屬于豆科植物，除含有瘋草毒素外，還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。其中黃花棘豆的粗蛋白含量高達20％，超過“飼料之王”的苜蓿，小花棘豆粗蛋白、鈣、磷含量及必需氨基酸組成接近于優(yōu)質(zhì)苜蓿，將甘肅棘豆的添加量控制在10％以內(nèi)飼喂家兔，家兔的體質(zhì)量增加量與棘豆飼喂量成正比，說明瘋草有較好的利用前景。

目前多采用免疫學(xué)方法使動物獲得抗苦馬豆素抗體，以期在動物采食瘋草時獲得保護。其免疫效果的確定有賴于抗體的準確檢測，ELISA法因具有快速、敏感、準確等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用。本課題組以家兔為試驗動物，通過制備苦馬豆素人工抗原，篩選包被抗原，制備陽性血清和陰性血清，制備HRP-羊抗兔酶標抗體，建立測定方法，從而得到檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒，為家兔安全利用瘋草提供基礎(chǔ)。而到目前為止，并未有家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒的研究報道和專利申請。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種設(shè)備簡單，操作方便的家兔血清抗苦馬豆素抗體檢測方法及試劑盒。通過該方法的實施，達到對家兔免疫效果的快速、敏感、準確的判斷，操作方法簡單易行，適用于科研院所和基層畜牧系統(tǒng)。

具體技術(shù)方案為：

一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，間接ELISA法檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體，包括以下步驟：

(1)包被：使用抗原包被緩沖液將苦馬豆素人工抗原稀釋到工作濃度，加入96孔酶標板，每孔100μL，4℃過夜；

(2)封閉：將孔內(nèi)抗原液棄去，加入PBST洗滌液，每孔200μL，振蕩30s后棄去孔內(nèi)液體，拍干。PBST洗滌液的配制方法：十二水磷酸氫二鈉2.9g，無水磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，吐溫-200.5mL，溶解于1000mL蒸餾水；重復(fù)洗滌3次后，每孔加入20g/L明膠溶液，將酶標板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h進行封閉；

(3)添加待檢血清及陽性、陰性血清：棄去孔內(nèi)明膠溶液，洗滌3次后，向每孔加入100μL工作濃度的待檢血清、陽性血清和陰性血清，并以PBS溶液為空白對照，將酶標板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h；

(4)添加酶標二抗：棄去孔內(nèi)血清，洗滌3次后，向每孔加入100μL工作濃度的HRP-羊抗兔酶標抗體，將酶標板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h；

(5)添加底物溶液：棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次后，向每孔加入100μL底物溶液，底物使用四甲基聯(lián)苯胺，即TMB，配置方法為：底物顯色A液：無水醋酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，30％雙氧水0.3ml，用蒸餾水定容于500mL；底物顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0.2g，檸檬酸0.95g，甘油50mL，0.15g?TMB，3mL?DMSO，用蒸餾水定容于500mL，使用時AB液等量混合，將酶標板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min；