[發明專利]一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201210525105.X
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN103048444A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 王帥;馬春暉;胡建軍;席琳喬;王連群;陳根元
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，間接ELISA法檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體，包括以下步驟：

(1)包被：使用抗原包被緩沖液將苦馬豆素人工抗原稀釋到工作濃度，加入96孔酶標板，每孔100μL，4℃過夜；

(2)封閉：將孔內抗原液棄去，加入PBST洗滌液，每孔200μL，振蕩30s后棄去孔內液體，拍干，PBST洗滌液的配制方法：十二水磷酸氫二鈉2.9g，無水磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，吐溫-200.5mL，溶解于1000mL蒸餾水；重復洗滌3次后，每孔加入20g/L明膠溶液，將酶標板置于37℃培養箱內培養1h進行封閉；

(3)添加待檢血清及陽性、陰性血清：棄去孔內明膠溶液，洗滌3次后，向每孔加入100μL工作濃度的待檢血清、陽性血清和陰性血清，并以PBS溶液為空白對照，將酶標板置于37℃培養箱內培養1h；

(4)添加酶標二抗：棄去孔內血清，洗滌3次后，向每孔加入100μL工作濃度的HRP-羊抗兔酶標抗體，將酶標板置于37℃培養箱內培養1h；

(5)添加底物溶液：棄去孔內溶液，洗滌3次后，向每孔加入100μL底物溶液，底物使用四甲基聯苯胺，即TMB，配置方法為：底物顯色A液：無水醋酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，30％雙氧水0.3ml，用蒸餾水定容于500mL；底物顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0.2g，檸檬酸0.95g，甘油50mL，0.15g?TMB，3mL?DMSO，用蒸餾水定容于500mL，使用時AB液等量混合，將酶標板置于37℃培養箱內培養30min；

(6)終止：將酶標板拿出培養箱后，立即向每孔加入2mol/LH₂SO₄溶液終止反應，立即使用酶標儀測定OD₄₅₀值，以待檢血清OD₄₅₀值(P)和陰性血清OD₄₅₀值(N)的比值(P/N)≥2.1判定樣品為陽性。

2.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(1)中，包被抗原選擇為SW-OVA，工作濃度為10μg/mL，抗原包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，配置方法為2.93g碳酸氫鈉和1.95g碳酸鈉溶解于1000mL蒸餾水。

3.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，血清稀釋度為1∶200，稀釋液選用包被緩沖液。

4.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，酶標二抗稀釋度為1∶1500，稀釋液選用包被緩沖液。

5.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，底物更換為四甲基聯苯胺二鹽酸，即TMB·2Hcl，在底物顯色B液中棄去DMSO。

6.一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括已包被完全的96孔酶標板(包被抗原為10μg/mL的SW-OVA)、陽性血清(抗體效價2¹²～2¹⁴)、陰性血清、HRP-羊抗兔酶標抗體PBS溶液、PBST洗滌液、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液。