[發(fā)明專利]一種DNA甲基化檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210524641.8
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN103031375A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高力;周陽;陳克平;張春霞;陳亮;連超群
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種DNA甲基化檢測試劑盒，并涉及一種使用該種試劑盒檢測DNA甲基化的方法。

背景技術(shù)

目前存在的幾種甲基化檢測方法，如甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，甲基化敏感單核苷酸引物延伸，DNA測序等存在一些局限性：甲基化的信息不完整、檢測的通量低、準(zhǔn)確性低等。

2004年英國曼徹斯特大學(xué)的兩位科學(xué)家安德烈·海姆（Andre?Geim）和康斯坦丁·諾沃肖羅夫（Konstantin?Novoselov）首次制備出是一種新型的二維碳納米材料-石墨烯，并獲2010年的諾貝爾物理學(xué)獎，受到了全世界研究人員的關(guān)注。

石墨烯氧化物是石墨烯的氧化物，其制備簡單，成本也比較低，對單鏈DNA有較強的吸附能力（N.Varghese,U.Mogera,A.Govindaraj,et?al.Chem?Phys?Chem2009,10,206–210;Z.Liu,J.T.Robinson,X.Sun,H.Dai,J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876–10877.)，單鏈DNA吸附到石墨烯氧化物上，雙鏈DNA從石墨烯氧化物上脫落。生物芯片是一種高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性，把生物芯片與石墨烯氧化物相結(jié)合，發(fā)展一種高通量、低成本、準(zhǔn)確、快速的DNA甲基化檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服一些檢測方法的缺陷，研制一種DNA甲基化檢測試劑盒及其檢測方法。

本發(fā)明所述DNA甲基化的檢測試劑盒，包括以下成分：

(1)反應(yīng)液A:0.3mg/ml的石墨烯氧化物溶液

(2)反應(yīng)液B:0.5mM的EDCI（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）

(3)反應(yīng)液C:1.0mM?sulfo-NHS（N-羥基硫代琥珀酰亞胺）。

本發(fā)明的還提供了一種DNA甲基化檢測試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其主要步驟包括：

1）制備具有石墨烯氧化物點陣的玻片，具體是將1ml反應(yīng)液A點在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗,加入1ml反應(yīng)液B和反應(yīng)液C后在37℃下保存60min；

2）待測DNA樣本的制備：從組織或血液中提取基因組DNA，以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，通過PCR擴增，制備待檢測的DNA樣本；

3）檢測探針吸附到具有石墨烯氧化物點陣的玻片：合成具有淬滅石墨烯氧化物檢測熒光物質(zhì)標(biāo)記的DNA甲基化檢測探針在雜交盒中和1）制備的玻片進行物理吸附12h，用PBS洗去多余的探針，掃描記錄玻片上石墨烯氧化物點陣的熒光強度；

4）DNA甲基化檢測：在3）中加入2）中制備的DNA樣本，在37℃下雜交60min，PBS沖洗后進行掃描，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值來檢測DNA甲基化。

本發(fā)明所述淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的物質(zhì)為AuNP或其他能淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的金屬顆粒。

本發(fā)明中，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值接近為0，加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度與未吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度接近1，證明檢測到DNA甲基化。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明把石墨烯氧化物和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合,能高通量、低成本、準(zhǔn)確、快速對DNA甲基化進行大規(guī)模檢測。

2.本發(fā)明充分運用單鏈DNA能吸附到石墨烯氧化物，雙鏈DNA脫離石墨烯氧化物的特性進行DNA甲基化檢測,具有較高的檢測特異性，實施簡單而且有效。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的流程示意圖。

圖2a)AuNP標(biāo)記的DNA吸附到石墨烯氧化物后的熒光圖，b)加入DNA甲基化樣本后熒光圖。

具體實施方式

下列實例進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)作本發(fā)明的限制。

實施例1：

按照下列配方制作一種DNA甲基化的檢測試劑盒

(1)反應(yīng)液A:0.3mg/ml的石墨烯氧化物溶液。

(2)反應(yīng)液B:0.5mM的EDCI。

(3)反應(yīng)液C:1.0mM?sulfo-NHS。

實施例2：

檢測流程如圖1。