[發(fā)明專利]一種檢測 TUBB3 mRNA 基因表達量的試劑盒及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210521384.2
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN103088124A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設計）人: 張偉;郭成賢;陳小平;劉昭前;周宏灝
• 申請（專利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測?TUBB3?mRNA?基因表達量的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

抗微管類藥物是一類以細胞微管蛋白為作用靶點的藥物。通過作用于細胞微管而影響紡錘體形成，并抑制細胞有絲分裂的一類廣譜化療藥。目前常用的抗微管類藥物主要有：紫杉醇、多西他賽、長春堿、長春新堿和長春瑞濱等。紫杉醇/多西他賽作用于腫瘤細胞后，可以促進腫瘤細胞內(nèi)的微管聚合以及穩(wěn)定已聚合的微管，導致細胞內(nèi)大量微管聚集，進而干擾細胞各種功能，特別是使細胞停止分裂。長春堿/長春新堿等可以抑制腫瘤細胞內(nèi)微管蛋白的聚合、抑制紡錘體微管的形成，使核分裂停滯于細胞分裂中期，從而抑制腫瘤細胞生長。

微管蛋白α和微管蛋白β構(gòu)成的α，β異二聚體是微管裝配的基本單位，也是許多抗微管類藥物的作用靶點。其中TUBB3編碼的β-tubulin-Ⅲ（Ⅲ型微管蛋白）與抗微管類藥物的療效關(guān)系最為密切。

多種腫瘤細胞系的研究及大量臨床試驗結(jié)果均顯示TUBB3?mRNA的表達水平與抗微管類藥物的療效密切相關(guān)?(Pascal?S?and?Charles?D.?Lancet?Oncol.?2008;9:168-75.)?。低表達患者接受紫杉醇類或長春堿類化療的效果較好，中位生存期較長。而TUBB3高表達的患者的抗微管類化療療效較差?(Pascal?S?and?Charles?D.?Lancet?Oncol.?2008;9:168-75.)?。

熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為本發(fā)明提供了一種操作簡單快速、易標準化、檢測費用低，準確可靠、定量檢測mRNA的方法。通過該方法可以快速檢測腫瘤細胞?(來源于腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細胞、穿刺標本、胸腹水等)?中TUBB3?mRNA的表達量，用于臨床醫(yī)生對抗微管類的合理化使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種檢測?TUBB3?基因mRNA表達量的熒光定量PCR檢測試劑盒，能簡單快速、準確可靠的檢測TUBB3基因。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種檢測TUBB3基因表達量的熒光定量PCR試劑盒，包含以下組成部分：

（1）TUBB3基因標準品：含有TUBB3基因編碼序列的重組載體，所述TUBB3基因編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；

（2）檢測TUBB3基因的上、下游引物：

TUBB3-上游引物：5’-?GGCCTCTTCTCACAAGTACG?-3’（SEQ?ID?NO.2）

TUBB3-下游引物：5’-?GAAGAGATGTCCAAAGGCCC?-3’（SEQ?ID?NO.3）

進一步，所述含有TUBB3基因編碼序列的重組載體的空載體為pUC57載體；

進一步，該試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

所述逆轉(zhuǎn)錄緩沖液為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，如5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液?(有濃度為50mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KCl、濃度為4?mmol/L的MgCl2和濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT組成)?等；所述逆轉(zhuǎn)錄引物?Oligo-(dT)?為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述?dNTPs?溶液為?dATP?(脫氧腺苷三磷酸)?的混合水溶液；所述定量?PCR?緩沖液為常規(guī)定量?PCR?緩沖液，如5×定量?PCR?緩沖液?(由濃度為10mmol/L，pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L?的?KCl?和濃度為2?mmol/L的?MgCl2?組成)?等。

本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測?TUBB3?mRNA?基因表達量的方法，包括以下步驟：

（1）從待測標本?(腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細胞、穿刺標本、胸腹水等)?中提取細胞總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

（2）分別將已知拷貝數(shù)的TUBB3基因標準品倍比稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10個拷貝數(shù)/μl；