[發明專利]一種檢測 TUBB3 mRNA 基因表達量的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201210521384.2
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN103088124A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 張偉;郭成賢;陳小平;劉昭前;周宏灝
• 申請（專利權）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

1.一種檢測?TUBB3?mRNA?基因表達量的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下組成部分：

（1）TUBB3基因標準品：含有TUBB3基因編碼序列的重組載體，所述TUBB3基因編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；

（2）檢測TUBB3基因的上、下游引物：

TUBB3-上游引物：5’-?GGCCTCTTCTCACAAGTACG?-3’；

TUBB3-下游引物：5’-?GAAGAGATGTCCAAAGGCCC?-3’。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述重組載體的空載體為pUC57載體。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

4.一種基于權利要求1至3任一項所述試劑盒檢測?TUBB3?mRNA?基因表達量的方法，包括如下步驟：

（1）從待測標本中提取總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉錄酶，將RNA逆轉錄為cDNA；

（2）分別將已知拷貝數的TUBB3基因標準品倍比稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10個拷貝數/μl；

（3）分別以步驟（1）所制備的cDNA及步驟（2）倍比稀釋的TUBB3基因標準品為模板，加入檢測TUBB3基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行熒光定量PCR；

（4）根據倍比稀釋的TUBB3基因標準品的循環閾值與初始拷貝數分別繪制TUBB3基因標準曲線，再根據待測cDNA的循環閾值，從標準曲線上讀取其含有的TUBB3基因的初始拷貝數。

5.根據權利要求?4?所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）的PCR擴增條件為：95^oC預變性3分鐘，然后95^oC變性30秒、55^oC退火40秒，共40個循環。