[發(fā)明專利]一種檢測(cè) ERCC1 mRNA 基因表達(dá)量的試劑盒及方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210521367.9
• 申請(qǐng)日: 2012-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103088123A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張偉;郭成賢;陳小平;劉昭前;周宏灝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)?ERCC1?mRNA?基因表達(dá)量的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

鉑類藥物是最常用的腫瘤化療藥物之一，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等。其藥理學(xué)機(jī)制主要是通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)?DNA的交聯(lián)，阻礙DNA?合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。DNA修復(fù)是鉑類藥物耐藥性產(chǎn)生的主要原因。ERCC1（excision?repair?cross?complementation?1，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1）是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，參與DNA鏈的切割和損傷修復(fù)過(guò)程。ERCC1表達(dá)量直接影響DNA的修復(fù)。

ERCC1在所有的腫瘤細(xì)胞中都存在表達(dá)，而且表達(dá)水平差異很大。臨床研究已證實(shí)ERCC1參與鉑類藥物耐藥的發(fā)生，其表達(dá)水平與多種腫瘤鉑類藥物化療的療效和生存期呈負(fù)相關(guān)?(Olaussen?KA?et?al.N?Engl?J?Med.2006;?355(10):?983-91.)?，即表達(dá)水平低的患者對(duì)鉑類藥物敏感，反之表達(dá)水平高的患者則耐藥。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）臨床實(shí)踐指南（第二版，2010）中明確指出：在接受鉑類藥物化療前進(jìn)行ERCC1基因水平的表達(dá)檢測(cè)?(NCCN?Clinical?Practice?Guidelines?in?Oncology?for?NSCLC.V2.2010.)?。

熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)費(fèi)用低，準(zhǔn)確可靠、定量檢測(cè)mRNA的方法。通過(guò)該方法可以快速檢測(cè)腫瘤細(xì)胞?(來(lái)源于腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、穿刺標(biāo)本、胸腹水等)?中ERCC1?mRNA的表達(dá)量，用于臨床醫(yī)生對(duì)鉑類的合理化使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)?ERCC1?基因mRNA表達(dá)量的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及方法，能簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)ERCC1基因。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種檢測(cè)ERCC1基因表達(dá)量的熒光定量PCR試劑盒，包含以下組成部分：

（1）ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品：含有ERCC1基因編碼序列的重組載體，所述ERCC1基因編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；

（2）檢測(cè)ERCC1?基因的上、下游引物：

ERCC1-上游引物：5’-?TGTCCAGGTGGATGTGAAAG?-3’（SEQ?ID?NO.2）

ERCC1-下游引物：5’-?GAGGATCAATGTGCAGTCGG?-3’（SEQ?ID?NO.3）

進(jìn)一步，所述含有ERCC1基因編碼序列的重組載體的空載體為pUC57載體；

進(jìn)一步，該試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

所述逆轉(zhuǎn)錄緩沖液為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，如5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液?(有濃度為50mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KCl、濃度為4?mmol/L的MgCl2和濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT組成)?等；所述逆轉(zhuǎn)錄引物?Oligo-(dT)?為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述?dNTPs?溶液為?dATP?(脫氧腺苷三磷酸)?的混合水溶液；所述定量?PCR?緩沖液為常規(guī)定量?PCR?緩沖液，如5×定量?PCR?緩沖液?(由濃度為10mmol/L，pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L?的?KCl?和濃度為2?mmol/L的?MgCl2?組成)?等。

本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測(cè)?ERCC1?mRNA?基因表達(dá)量的方法，包括以下步驟：

（1）從待測(cè)標(biāo)本?(腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、穿刺標(biāo)本、胸腹水等)?中提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

（2）分別將已知拷貝數(shù)的ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10個(gè)拷貝數(shù)/μl；

（3）分別以步驟（1）所制備的待測(cè)cDNA及步驟（2）倍比稀釋的ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入檢測(cè)ERCC1基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR；