[發(fā)明專利]一種檢測(cè) ERCC1 mRNA 基因表達(dá)量的試劑盒及方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210521367.9
• 申請(qǐng)日: 2012-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103088123A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張偉;郭成賢;陳小平;劉昭前;周宏灝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

1.一種檢測(cè)?ERCC1?mRNA?基因表達(dá)量的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下組成部分：

（1）ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品：含有ERCC1基因編碼序列的重組載體，所述ERCC1基因編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；

（2）檢測(cè)ERCC1基因的上、下游引物：

ERCC1-上游引物：5’-?TGTCCAGGTGGATGTGAAAG?-3’；

ERCC1-下游引物：5’-?GAGGATCAATGTGCAGTCGG?-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述重組載體的空載體為pUC57載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

4.一種基于權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述試劑盒檢測(cè)?ERCC1?mRNA?基因表達(dá)量的方法，包括如下步驟：

（1）從待測(cè)標(biāo)本中提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

（2）分別將已知拷貝數(shù)的ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10個(gè)拷貝數(shù)/μl；

（3）分別以步驟（1）所制備的待測(cè)cDNA及步驟（2）倍比稀釋的ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入檢測(cè)ERCC1基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR；

（4）根據(jù)倍比稀釋的ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制ERCC1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)cDNA的循環(huán)閾值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的ERCC1基因的初始拷貝數(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求?4?所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）的PCR擴(kuò)增條件為：95^oC預(yù)變性3分鐘，然后95^oC變性30秒、52^oC退火40秒，共38個(gè)循環(huán)。