[發明專利]一種棉鈴蟲COPI β基因cDNA及其應用

有效

• 申請號: 201210520051.8
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN103849625A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 毛建軍;曾凡榮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/10;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
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技術領域

本發明屬于昆蟲分子生物學與生理學領域，具體涉及棉鈴蟲衣被蛋白I(coatomerprotein?I)β亞基(COPI?β)cDNA的克隆，棉鈴蟲COPI?β基因小RNA(siRNA)的設計，合成與對棉鈴蟲幼蟲的飼喂。

背景技術

棉鈴蟲(Helicoverpa?armigera)，夜蛾科昆蟲的一種，是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。棉鈴蟲是一種世界性分布的害蟲，國內各棉區均有分布和為害，北方棉區比南方棉區受害嚴重。棉鈴蟲為多食性害蟲，除為害棉花外，還能為害小麥、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等作物，寄主植物多達20多科200余種。20世紀90年代左右，棉鈴蟲在我國連年暴發成災，給棉花、玉米和蔬菜等作物生產帶來了嚴重的威脅。據統計，1992年棉鈴蟲在我國各種作物上累計發生面積達2192萬公頃，造成直接經濟損失逾百億元。

目前表達有殺蟲劑的轉基因植物已成為世界上作物害蟲治理的重要手段。2007年，全世界此類轉基因植物的種植面積為4210萬公頃，占所有轉基因植物總數的37％。其中轉有蘇云芽孢桿菌(Bt)中殺蟲劑基因的Bt棉全世界種植面積達1400萬公頃。我國1997年開始種植轉基因Bt棉，至2007年已達到380萬公頃。2011年，全世界轉基因抗蟲棉的種植面積達到6600萬公頃。

但害蟲基因突變可能危及轉基因作物的抗蟲功效，目前至少已發現9種害蟲進化出不同程度的Bt抗性。研究表明，棉鈴蟲在大田環境中比在實驗室條件下更容易產生遺傳突變。中國北方轉基因Bt棉田棉鈴蟲的大部分抗性等位基因為隱性的鈣粘蛋白突變，包含通過實驗室篩選鑒定的刪除突變。因此，尋找新的殺蟲靶標，培育新的抗蟲種質，避免或延緩害蟲抗性的產生是一項非常緊迫的工作。

RNA干擾(RNA?Interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double?stranded?RNA，dsRNA)引起的同源mRNA特異性降解的現象，小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉機制中發揮關鍵作用。RNA干涉普遍存在于植物、動物和真菌中，是真核生物中存在的一種抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監控機制，在農業害蟲生物防治領域具有廣闊的應用前景。1998年，Kennerdell與Carthew首次利用RNAi技術研究了黑腹果蠅frizzled與frizzled?2基因的功能。隨后的眾多研究也表明，在注射或進食靶標序列dsRNA后，昆蟲靶標基因的表達也可被有效阻斷。通過體外顯微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害蟲稻飛虱不同表達模式的基因。黃曲條跳甲在注射跨膜氣味受體基因PsOr1dsRNA后，對十字花科寄主的偏好性減弱。棉鈴蟲有一受棉酚誘導的P450基因GIP，當棉鈴蟲幼蟲進食表達dsGIP的轉基因煙草后，幼蟲中腸組織中GIP的轉錄水平被顯著抑制并伴隨過氧化氫酶活性的上升，同時由于棉鈴蟲中腸內的GIP表達的下調而使幼蟲生長受到抑制，對棉酚的耐受性降低。此外，通過dsRNA飼喂對白蟻內源纖維素基因與Hexamerin儲存蛋白基因的干擾具有致死與致畸效應。經dsRNA飼喂后默岡比亞按蚊的幾丁質酶基因可被有效沉默。在水稻中表達跨膜轉運蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻對稻褐飛虱的抗性。目前很少有通過siRNA沉默害蟲靶標基因的報道。

衣被蛋白I(coatomer?protein?I：COPI)是真核細胞內一種負責跨膜運輸的蛋白質，由7個亞基組成。真核細胞內部內膜系統各個部分之間的物質傳遞常常通過膜泡運輸方式進行，如從內質網到高爾基體；高爾基體到溶酶體；細胞分泌物的外排，都要通過過渡性小泡進行轉運。大多數運輸小泡是在膜的特定區域以出芽的方式產生的。其表面具有一個籠子狀的由蛋白質構成的衣被(coat)。這種衣被在運輸小泡與靶細胞器的膜融合之前解體。衣被能選擇性地將特定蛋白聚集在一起，形成運輸小泡，并如同模具一樣決定運輸小泡的外部特征。COPI是已知的三類具有代表性的衣被蛋白之一。其負責回收、轉運內質網逃逸蛋白(escapedproteins)返回內質網，使逃逸蛋白返回正常駐留的部位，這樣內質網不會因為磷脂和某些蛋白質的匱乏而停止工作。COPI衣被小泡還可以介導高爾基體不同區域間的蛋白質運輸。由此可見，COPI在真核生物的新陳代謝中發揮基礎與關鍵的作用。