[發(fā)明專利]利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法

無效

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• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN102944638A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設計）人: 曹墨菊;榮廷昭;張晨;張艷花;汪靜;盧艷麗;劉和洋;汪瀚宇;王繼玥;曾文兵;汪生慶;劉堅;高世斌;周樹峰;胡爾良
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發(fā)明涉及，尤其涉及的是一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法。

背景技術

隨著DNA甲基化研究的逐步深入，DNA甲基化水平的檢測已發(fā)展成為一門內容豐富的方法學。DNA甲基化常用的分析方法為MSAP法，該法被廣泛應用于水稻、棉花和擬南芥等基因組的胞嘧啶甲基化評定。但是，MSAP法所使用的同裂酶（如HpaII和MspI）不能切割所有的甲基化位點，識別范圍有限。相比較而言，HPLC法能方便、快速、準確地測定整個基因組的甲基化水平，它能在宏觀上對整個基因組的DNA甲基化水平進行大規(guī)模的分析測定，這恰恰是具有識別位點特異性的MSAP法所不具備的。HPLC法是生物化學、分子生物學、醫(yī)藥學等學科領域與專業(yè)最為重要的分離分析技術，也可以應用于測定全基因組DNA甲基化水平。繼Wagner等首次用HPLC法測定植物5mC的含量以來，該法被廣泛應用于植物DNA甲基化水平的檢測。Johnston等^[2]用該方法對茶藨子基因組中5mC含量進行了分析，丁明麗用該法測定了小麥成熟胚脫分化過程中的DNA甲基化水平，表明HPLC方法可達到對植物DNA甲基化水平精確分析的目的。因此，運用高效液相色譜法能夠更加準確、全面地測定DNA甲基化水平。

核酸的酶水解通常采用核酸酶P1、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶將DNA水解為脫氧核苷后進行測定。核酸酶P1只能對DNA的單鏈產生作用；核酸酶P1的最適反應溫度高于另外兩種酶，而最適pH值卻低于另外兩種酶，這就意味著三種酶不能同時作用，而且需人為地調節(jié)pH值，使實驗顯得格外繁瑣。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份1μg?DNA的水解混合液配制方法為：將250U?Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL?pH為7.9的Tris-HCl水解緩沖液內；流動相的pH：對于線粒體DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.42；對于細胞核DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.0；色譜條件為：色譜柱：C18填料色譜柱；流速：0.8?mL/min，檢測器波長：287nm；柱溫：35℃；進樣量：20uL；流動相：甲醇：5mM戊烷磺酸鈉：三乙胺（10：90：0.2，V/V），并用磷酸調節(jié)pH分別至3.42和3.0。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。

(1)?利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解體系，根據每ug?DNA加上一定量的水解液，37℃水解6個小時即能獲得脫氧核苷。此法簡單、經濟、有效。

(2)?對線粒體DNA和細胞核DNA甲基化水平的檢測條件有所不同：流速、進樣體積、柱溫箱溫度均一致，但是流動相的pH不一樣。線粒體DNA分析時需要的pH略高于細胞核DNA，這樣才能使各時各組分得到較好的分離。

(3)?經過優(yōu)化的色譜條件為，色譜柱：C18填料色譜柱（4.6×250mm，5um）；流速：0.8?mL/min，檢測器波長：287nm；柱溫：35℃；進樣量：20uL；流動相：甲醇：5mM戊烷磺酸鈉：三乙胺（10：90：0.2，V/V），并用磷酸調節(jié)pH分別至3.42和3.0。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。

附圖說明

圖1為標準品及樣品經水解后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；

圖2為DNA標準品水解后HPLC色譜圖；

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

DNA樣品經酸或酶水解成堿基/核苷/核苷酸，本實驗利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解混合液，可供處理100份1μg?DNA的水解混合液配制方法為：將250U?Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL?pH為7.9的Tris-HCl水解緩沖液內。