[發明專利]魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法

無效

• 申請號: 201210518784.8
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103060259A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 沙珍霞;陳松林;鄭媛;王娜;謝明樹
• 申請（專利權）人: 沙珍霞
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12R1/91
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙) 11316
• 代理人: 滑春生

技術領域

本發明涉及一種體外培養的魚類細胞系的方法，屬于生物細胞培養技術領域。

背景技術

體外培養的魚類細胞系是廣泛應用于病毒學、免疫學、毒理學、發育生物學、腫瘤學基因組學、遺傳學以及資源保護等方面的重要工具。截至目前已相繼建立近280余株不同魚類細胞系，在生理學、病毒學、毒理學、腫瘤及基因工程等領域發揮重要作用。

半滑舌鰨（Cynoglossus?semilaevis?Gunther）在我國主要分布于渤海、黃海海域，其肉質細膩、鮮美，營養豐富，經濟價值高，自然資源量少。半滑舌鰨自2003年人工繁殖獲得成功后，近年來已經成為我國北方主要的養殖種類，養殖年產值超過10億元。隨著養殖業的快速發展，魚病給養殖業造成巨大損失，病原包括細菌、病毒、寄生蟲等。對半滑舌鰨致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究是從根本上解決病害問題的方法，細胞系作為一種體外培養系統，因其成本低、試驗重復性好、條件可精確控制的優點，是其中必不可少的研究工具。

迄今為止，雖然有文獻報道半滑舌鰨胚胎細胞系（中國水產研究院黃海水產研究所，沙珍霞，Acta?Oceanologica?Sinica?.vol.29.No.2:81-87）、心肌細胞系（中國水產研究院黃海水產研究所，王賢麗，Fish?Physiol?Biochem??36:1181–1189）、肝臟細胞系（中國水產研究院黃海水產研究所，任國誠，High?technology?communication.18（6）：657-660）、精巢細胞系（中國水產研究院黃海水產研究所，張博，Int.J.Biol.7(4):452-459）等4個細胞系的建立，但是仍未見頭腎來源細胞系的報道。

頭腎（又名前腎）是魚類的主要免疫器官，建立半滑舌鰨頭腎來源體外細胞系，可以更有針對性地研究病原在體外培養條件下的致病機理，也可以為研究免疫抗病基因功能提供細胞平臺。

發明內容

本發明的目的在于提供一種建立魚類頭腎來源細胞系的方法。本發明所要解決的技術問題是：通過選擇細胞培養液，選取合適頭腎組織經過原代培養和傳代培養，獲得可以連續傳代，且細胞能維持良好生長狀態的頭腎來源細胞。作為優選的，本發明的魚類是半滑舌鰨。

本發明提供的技術方案是：一種魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，包括以下步驟：

1、頭腎組織的處理：將頭腎組織剪成小塊，加入胰蛋白酶進行消化，加入，細胞培養液終止消化，收集經消化處理的組織細胞懸液，離心去除上清；

2、原代培養：加入細胞培養液重懸后于培養箱中培養；

3、傳代培養：原代培養細胞開始增殖至組織塊周圍細胞暈停止生長后，加入胰蛋白酶消化懸起細胞，利用細胞培養液進行傳代培養；

優選地，其中所述魚類為半滑舌鰨。

其中，采用的細胞培養液為在基礎細胞培養液中添加胎牛血清、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子，優選進一步含有青霉素和/或鏈霉素。所述基礎培養液優選pH為7.0-7.3，更優選為MEM培養基，最佳選用購自GIBCO公司MEM培養基。更具體的是，在使用時向基礎細胞培養液中添加上述各種物質。

進一步的，其中胎牛血清添加量為占細胞培養液總體積10-20%的胎牛血清，最佳為20%；丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子在細胞培養液中的添加量分別達到0.1-5?mM、10-100?mM、1-20?ng/ml，優選為1?mM、50?mM、10ng/ml。青霉素和/或鏈霉素可按常規量添加，通常添加100?U/ml的青霉素，100?U?/ml的鏈霉素。

上述第2步驟中，所述培養中在24℃培養箱中培養，每隔7天半量更換細胞培養液一次。

上述第3步聚傳代培養更優選為：原代培養獲得的用添加上述細胞培養液將細胞稀釋至2×10⁵細胞/ml濃度進行原瓶傳代培養；當瓶底細胞長至單層后在傳代中以2×10⁴-2×10⁵細胞/ml濃度進行分瓶接種，傳代間隔期為3-7天；傳至11代以后，細胞培養液中的胎牛血清含量減為5%-15%。

本發明具有以下有益效果：通過本發明方法建立的細胞系可以在大致室溫條件下連續傳代，且細胞能維持良好生長狀態，可以對其進行冷凍保存，能提供大量的頭腎來源細胞。由于于頭腎是魚尤其對于半滑舌鰨而言是重要的免疫器官，因此，所建細胞系為開展病原特性及其致病機理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相關領域的理論與應用研究提供了便利。

附圖說明