[發明專利]超靈敏黃曲霉毒素B1酶聯免疫檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210517982.2
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103018458A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 時國慶;孫清;楊敬臣;李谷豐
• 申請（專利權）人: 北京普贊生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分析檢測試劑領域，更具體地說，涉及一種檢測黃曲霉毒素B₁的酶聯免疫分析測定試劑盒及其制備、使用方法。

背景技術

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一種極強的劇毒物質，已被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為1類致癌物。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產毒菌株的代謝產物，普遍存在于霉變的糧食、飼料及其制品中。黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁及G₂是糧食和食品中黃曲霉毒素主要存在形式，其中黃曲霉毒素B₁的毒性和致癌性最強。由于自然界黃曲霉產毒菌株產生的毒素以AFB₁的為主，而且其毒性和致癌性最大，因此，在檢驗中通常都以AFB₁作為分析指標。

黃曲霉毒素B₁的分子式為C₁₇H₁₂O₆，化學結構如下：

其結構中含有一個雙呋喃環和一個香豆素，前者為基本毒性結構，后者與其致癌性有關。黃曲霉毒素B1對雛鴨的半致死量僅為0.3mg/kg體重，其毒性為氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。當食品、飼料及其相關制品保存不當極易受到黃曲霉毒素B1的污染，黃曲霉毒素B1進入人體后，其主要靶器官為肝臟，急性中毒癥狀為惡心、嘔吐、胃腸大出血而死亡。慢性中毒主要會引起肝癌，還可以誘發骨癌、腎癌、直腸癌等。目前，我國規定各種食物或飼料中黃曲霉毒素B₁的最高允許量根據來源不同為0.5～20.0μg/Kg。國際上AFT最大允許含量不斷降低，2004年歐盟再次修訂對嬰兒和兒童食品中AFT的限量標準，包括谷類食品在內的嬰幼兒食品以及具有特殊醫療目的的嬰兒食品，AFB1的最大允許限量均為0.10ug/kg。因此，建立簡便，快捷，超靈敏，低濃度預警的黃曲霉毒素B1檢測方法顯得尤為重要。

目前，國內檢測黃曲霉毒素常用的儀器方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、微柱層析法。薄層色譜法是最早應用于黃曲霉毒素檢測的方法，在黃曲霉毒素鑒定分離方面具有重要地位。其原理是利用樣品中的黃曲霉毒素與其它物質在固定相硅膠和流動相中的分配系數不同，達到分離的目的，再用365nm波長的紫外線激發黃曲霉素產生熒光，根據熒光的強弱與標準品比較測定含量。但此方法靈敏度低、特異性不強，樣品處理繁瑣，分析時間長，進行目測定量分析時主觀性影響較大。黃曲霉毒素的高效液相色譜法包括正相液相色譜法(NP-HPLC)和反相液相色譜法(RP-HPLC)，檢測器可用紫外檢測器和熒光檢測器，由于HPLC-熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高30-40倍，所以目前多使用HPLC-熒光檢測器。但此法測定中最大問題是主要黃曲霉毒素的熒光發射依賴于溶劑的組成，黃曲霉毒素B1的熒光強度較強但在含水的溶劑中容易發生淬滅。微柱層析法主要利用硅鎂型吸附劑吸附黃曲霉毒素后，在365nm波長紫外燈下呈藍紫色熒光帶，再與系列定量標準溶液的微柱管比較進行半定量，靈敏度為5-10ug/kg，回收率在90％以上，但需其他分析方法進一步測定確認。這些方法測定的準確度較高，重復性較好，但往往需配備大型較昂貴的設備，費用高，對操作人員要求高，一般適于在國家或地區級研究所或科研單位大型實驗室中應用。

隨著生物技術的不斷發展，免疫分析法的應用開辟了黃曲霉毒素B1檢測的新領域。目前常用的方法有放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶聯免疫分析法等。其中，放射性免疫分析雖高靈敏、高特異性，但存在有效期短、具有放射性污染的問題；熒光免疫分析法雖然特異性強、敏感性高、速度快，但非特異性染色問題尚未解決，結果判定的客觀性不足，程序也比較復雜。而酶聯免疫法集合了抗原抗體反應的高特異性與酶促反應的高度敏感性。這種方法靈敏度高，比薄層法提高了近200倍；特異性強，熒光物質、色素、結構類似物對結果無干擾；而且回收率高，提取方法簡單，可進行定性定量測定。但目前黃曲霉毒素B₁的酶聯免疫分析方法的檢測限通常只能達到0.1ng/mL，而對于更低濃度的黃曲霉毒素B₁則不能進行準確定量。由于黃曲霉毒素B₁的慢性毒性強，若能在產黃曲霉毒素細菌生長的初期就將其鑒別出來，對于社會、經濟效益均有重要意義，因此，我們研發了比傳統酶聯免疫試劑盒靈敏度更高的超靈敏黃曲霉毒素B₁檢測試劑盒。

發明內容