[發明專利]一種利用基因工程提高球孢白僵菌高滲、氧化脅迫抗性和毒力的方法

無效

• 申請號: 201210516164.0
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103173467A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 張永軍;何張江;羅志兵;裴炎;范艷華
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/80;C12N1/15;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及利用基因工程方法改良真菌性狀。

背景技術

昆蟲病原真菌是一類重要的昆蟲病原微生物，是自然界控制昆蟲種群的一類重要自然控制因子(Clarkson?et?al.，1996，Trends?Microbiol.，4：197-203；Feng?etal.，1994，Biocontrol?Sci.Technol.，4：3-34；Roberts?et?al.，2004，Adv.Appl.Microbiol.，54：1-70)。其中白僵菌(Beauveria)、綠僵菌(Metarhizium)、棒束孢(Isaria)、輪枝孢(Verticillium)等絲孢類真菌由于其顯著的流行潛力和生產的便利性，被廣泛用于農、林以及衛生害蟲的生物防治。而且，與細菌和病毒類昆蟲病原微生物通過消化道侵染方式不同，昆蟲病原真菌是唯一直接穿透體壁侵染昆蟲的微生物，對于控制將口針直接插入植物韌皮部吸食汁液的刺吸式口器害蟲如蚜蟲、葉蟬、飛虱等具有獨到優勢(Hajek?et?al.，1994，Annu.Rev.Entomol.，39：293-322；St.Leger?et?al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：6349-6354)。因此，開發和應用真菌殺蟲劑受到國內外的廣泛關注，目前全球注冊登記的真菌制劑多達170余種，用于防治農、林以及衛生害蟲(de?Faria?et?al.，2007，Biol?Control，43：237-256)。

然而，真菌制劑在田間應用時，往往受到紫外輻射、干旱、氧化、變化的溫度等環境因素的影響，在很大程度上影響了真菌制劑應用效果的穩定性，限制了其應用范圍(Braga?et?al.，Mycol.Res.，105：874-882；Hallsworth?et?al.，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18：8-11；Rangel?et?al.，2004，J.Invertebr.Pathol.，87：77-83)。如昆蟲病原真菌孢子萌發或侵染初期，需要較高的相對濕度(RH＞95％)和適宜的溫度(25-28℃)，而田間的干燥環境和變化的溫度往往難以滿足侵染所需的適宜條件(Hallsworth?et?al.，Microbiology，141：1109-1115)。可見，揭示真菌制劑環境適應性的分子機制，利用基因工程提升真菌制劑的對環境的適應性或抗逆性，對促進真菌制劑應用具有重要意義。

近年來，隨著病原真菌逆境適應性反應分子機理的重視，嘗試利用基因工程改良菌株的抗性水平和毒力已成為可能。色素可以增強真菌在不良環境條件下的存活力和競爭力。羅伯茨綠僵菌(Metarhizium?robertsii)產生暗綠色孢子，但不產生DHN黑色素，將真菌Alternaria?alternate的DHN黑色素合成途徑轉入綠僵菌顯著增強了菌株對紫外輻射和高溫(35℃)的耐受力(Tseng?et?al.，2011，Appl?Environ?Microbiol，77：4508-4519)。同樣，將來源于曲霉Aspergillusfumigatus的酪氨酸酶基因轉入球孢白僵菌提高了色素沉積，增強了菌株對紫外輻射的耐受性(Shang?et?al.，2012，J?Invertebr?Pathol，109：105-109)。紫外輻射不僅損傷真菌DNA，而且產生活性氧使細胞處于高水平氧化脅迫(Lesser，1996，Limnol?Oceanoge，41：271-283)。病原真菌在氧化脅迫下，產生一系列的抗氧化酶是防御細胞受到傷害的重要方式。這些抗氧化酶包括細胞質、線粒體和分泌到胞外的過氧化氫酶(Cat)、過氧化氫酶-過氧化物酶(Cat-Pox)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及谷胱甘肽系統、過氧化氧化還原蛋白(Tsa)和硫氧還蛋白(Thioredoxin)系統等。在昆蟲病原真菌球孢白僵菌中超量表達Mg-SOD編碼基因，顯著提高了病原菌清除活性氧的能力，增強了紫外耐受性和毒力(Xie?et?al.，2010，Appl?Microbiol?Biotechnol，86：1541-1553)。胞內碳水化合物的貯存與病原真菌熱耐受性相關。抑制綠僵菌M.acridum海藻糖酶基因表達顯著增強了菌株的熱耐受性，但對菌株毒力沒有影響(Leng?et?al.，2011，BMC?Microbiology，doi：10.1186/1471-2180-11-32)。

目前，有關通過破壞穿膜蛋白編碼基因或改變穿膜蛋白基因表達方式增強菌株抗逆性和毒力的研究尚無報道。