[發(fā)明專利]一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210514757.3
• 申請(qǐng)日: 2012-12-05
• 公開（公告）號(hào): CN102993293A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙忠衛(wèi);劉建;馬亞平;袁建成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/635
• 分類號(hào): C07K14/635;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248
• 代理人: 韓英杰;許建

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及特立帕肽醋酸鹽的純化方法。

背景技術(shù)

特立帕肽，英文名Teriparatide，分子式為C₁₈₁H₂₉₂N₅₅O₅₁S₂。特立帕肽（pTH（1-34））是一個(gè)34肽，也稱人甲狀旁腺激素(1-34)。特立帕肽是人甲狀旁腺激素（Parathyroid?Hormone，human）?氨基端的1-34個(gè)氨基酸組成的多肽，由美國Eli?Lilly公司研發(fā)，以特立帕肽醋酸鹽作為藥品使用，屬于基因重組藥物，2002年被美國FDA批準(zhǔn)上市。它是第1個(gè)被批準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥的骨形成促進(jìn)劑，有較廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景。?

目前涉及到特立帕肽合成的文獻(xiàn)和專利較多，但涉及到純化的較少，特別是本發(fā)明的反相色譜和鹽析相結(jié)合的規(guī)模化純化制備（一批可得精品200克以上）和高純度且達(dá)到藥用級(jí)（純度達(dá)99.5%以上，最大單雜0.1%）更是沒有涉及。

現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A公開了一種特立帕肽的純化方法，采用水作為溶劑，然后以0.2%TFA/乙腈為流動(dòng)相采用C18柱進(jìn)行純化，然后用0.2%醋酸/乙腈C18柱轉(zhuǎn)鹽，雖能得到較高純度的特立帕肽醋酸鹽，但總收率只有20%左右，不利于產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)。

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在收率低的難題，提高特立帕肽醋酸鹽的純化收率，降低生產(chǎn)成本，還需對(duì)純化方法進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出了一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法，純度高且收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，綜合考慮特立帕肽本身的性質(zhì)，本發(fā)明提供的一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法包括以下步驟：

步驟1）：以體積比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照濃度20g/L—50g/L溶解粗肽；用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10%—30%。步驟1）下文也表述為“前處理”。

“粗肽溶液”是指粗肽經(jīng)過前處理后所得到的溶液，所使用的水為純凈水，并符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選超純水；所使用的醋酸為分析純的冰醋酸，本發(fā)明的“乙腈”的純度級(jí)別優(yōu)選色譜純。

選擇體積比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液混合溶劑系統(tǒng)是通過對(duì)比試驗(yàn)考慮實(shí)際生產(chǎn)過程的操作方便得出的，不在該濃度的溶劑溶解的濃度會(huì)變低，導(dǎo)致樣品溶解體積過大，不利于反相色譜的處理（會(huì)導(dǎo)致體積過載，純化效率低）。

現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A采用水作為溶劑，其會(huì)影響純化洗脫系統(tǒng)所使用有機(jī)溶劑的濃度，需要洗脫系統(tǒng)較長時(shí)間來平衡色譜柱，采用其他溶劑溶解粗肽會(huì)引入新的溶劑（導(dǎo)致成品引入新的有機(jī)溶劑殘留，影響成品質(zhì)量。

將制備的粗肽的濃度控制在20g/L—50g/L有利于純化效率，高于50g/L會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，低于20g/L會(huì)使純化效率低下。

用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10%—30%，當(dāng)醋酸和乙腈的比例高于30%此范圍的溶劑會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，當(dāng)醋酸和乙腈的比例低于10%會(huì)使樣品析出，導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化無法進(jìn)行。

步驟2）：將粗肽溶液進(jìn)行梯度洗脫純化，以0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%醋酸水溶液（體積比，用氨水調(diào)pH值5.0—6.0，優(yōu)選5.5）為A?相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—40%；步驟2）下文也表述為“純化”。

選擇0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%醋酸兩種酸用氨水調(diào)節(jié)后生成兩種緩沖鹽的A相是優(yōu)化選擇的結(jié)果，較現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A采用0.2%TFA具有更好的分離效果。流動(dòng)相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動(dòng)相緩沖能力變?nèi)酰瑢?dǎo)致樣品不能完全洗脫且譜圖變形達(dá)不到分離的要求。大于此范圍，流動(dòng)相A中緩沖鹽的濃度過高對(duì)色譜系統(tǒng)損傷較大，甚至?xí)糠之a(chǎn)生鹽析，導(dǎo)致無法純化。另外，流動(dòng)相A的pH值也非常重要，不在5.0—6.0范圍達(dá)不到分離效果。

洗脫系統(tǒng)中A相和B相的比例是通過大量實(shí)驗(yàn)篩優(yōu)選得到的，B%低于20%樣品不能沖洗下色譜柱，B%大于40%樣品會(huì)提前沖出，都不能進(jìn)行純化。采用該溶劑系統(tǒng)純化，分離效果較現(xiàn)有技術(shù)會(huì)大幅提高，本步的收率90%左右，所得樣品的純度在95%以上，大大提高收率和純度，降低了生產(chǎn)成本。