[發明專利]低密度脂蛋白中膽固醇的多重定量方法

有效

• 申請號: 201210513016.3
• 申請日: 2005-03-30
• 公開（公告）號: CN103122372A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 松本京子;松井寬史
• 申請（專利權）人: 電化生研株式會社
• 主分類號: C12Q1/60
• 分類號: C12Q1/60;C12Q1/44;C12Q1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 郭文潔;權陸軍

本申請是申請日為2005年3月30日，申請號為200580017679.4的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及同時測量生物樣品中作為被分析物的低密度脂蛋白中膽固醇和總膽固醇的方法，特別涉及可以穩定用于測量的液體試劑的方法。

背景技術

低密度脂蛋白（以下稱作“LDL”）在血液膽固醇運輸中起主要作用，特別是，在動脈粥樣硬化病例中血管壁上沉積的絕大部分膽固醇來自LDL。LDL膽固醇的增加是動脈粥樣硬化疾病的主要危險因素，因此在臨床上對其選擇性定量是很有用的。總膽固醇測量包括測量所有的脂蛋白，例如乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、LDL以及高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇，總膽固醇測量仍然是脂類檢驗的主要項目。

定量LDL膽固醇的常規方法包括一種包含分級分離和膽固醇定量兩個操作的方法以及基于總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯值依照Friedewald方程通過計算的定量方法。

對于分級分離，包括了諸如超速離心、沉淀和免疫學技術的方法。這些方法需要通過離心或過濾處理樣品，考慮到便利和經濟的原因，很難在實驗室檢驗部門推廣應用。基于Friedwald方程的計算方法因不考慮個體變異，所以在精確度上有問題，限制了其使用。

近來，業已報道了不需要分級分離的定量LDL膽固醇的方法（特開平11-318496號公報），其在檢驗作為臨床檢驗用試劑時適用。該方法包括第一步，選擇性除去樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇（“除去”意思是降解酯型膽固醇，并使降解產物在第二步中不被檢測到），以及第二步定量LDL膽固醇。

盡管上述用于LDL膽固醇測量的試劑在臨床上很有用，但是該試劑并沒有得到廣泛使用，這是因為一直廣泛地進行總膽固醇的常規測量，并且可以通過Friedewald方程等測定LDL膽固醇水平。然而，如上所述，通過Friedewald方程測定的LDL膽固醇水平存在問題，并且，LDL膽固醇水平的精確測量具有臨床意義。因此，期望進一步改進該試劑，由此推廣使用臨床意義高的測量LDL膽固醇的試劑。

另一方面，下述文獻中披露了單次測定連續測量HDL中膽固醇和總膽固醇以及LDL中膽固醇和總膽固醇的方法（特表2003-501630號公報）。在該方法中，將樣品放入試管中，使樣品中非HDL膽固醇和抗apoB抗體之間形成復合物，并測量未參與形成復合物的脂蛋白，即HDL。接著，用表面活性劑解離復合物，并通過酶測定剩余的非HDL膽固醇。可通過將兩次測量獲得的值加起來得到總膽固醇水平。就LDL膽固醇來說，使用了類似的反應方法，其中在復合物形成時使用的是抗apoA-I或抗apoA-II抗體而非抗apoB抗體。常規測量HDL膽固醇、LDL膽固醇和總膽固醇在醫學檢查等領域中廣泛應用，因此，同時測量HDL膽固醇、LDL膽固醇和總膽固醇很有意義。

專利文件1：特開平11-318496號公報

專利文件2：特表2003-501630號公報

發明概述

本發明的目的是提供一種抑制下述試劑自發顯色的穩定化方法，所述試劑用于通過一次測定同時定量LDL膽固醇和總膽固醇。該方法作為一種多重定量方法，其中單次測量就可獲得多個項目的定量值。

鑒于最近引起注意的LDL膽固醇的精確測量的重要性，以及通常已知的總膽固醇測量的重要性，本發明人堅持不懈地研究以建立同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的系統。

本發明人已開發了一種能同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的方法（特愿2002-362970，PCT/JP03/15995）。該方法包括在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑存在下，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于脂蛋白，通過將所產生的過氧化氫轉化為醌染料來測量除LDL外的脂蛋白中膽固醇，隨后添加至少作用于LDL的表面活性劑，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于殘留的LDL，并通過將所產生的過氧化氫轉化為醌染料來測量LDL膽固醇，在此可通過對上述兩次測量值求和計算總膽固醇值。該方法是一種有效的多重定量方法，其中單次測量就可獲得多個項目的定量值。但是，在該方法中，存在于第一試劑中的、產生醌染料的成分以液體試劑的形式使用，因此該試劑被空氣氧化，帶來了自發顯色和液體試劑缺乏穩定性的問題。

因此，本發明人堅持不懈地針對用于單次測量就能同時定量LDL膽固醇和總膽固醇的試劑的穩定性進行研究，終于找到了一種通過抑制在同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的方法中所用試劑自發顯色來穩定地測量LDL膽固醇和總膽固醇的可靠方法。